Đề tài: PHƯƠNG PHÁP PCR

PCR ( Polymerase Chain Reaction ) là phản ứng chuỗitrùng hợp hay còn gọi là "phản ứng khuếch đại gen“.Trong ngành thủy sản việc áp dụng kỹ thuật PCR đểphát hiện ra các mầm bệnh do virus gây ra như bệnh đốmtrắng,bệnh đầu vàng, hội chứng Taura… trên tôm.PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNAđặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi gắn vào 2 sợi đơn của đoạnDNA đích với sự tham gia của DNA polymerase....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Đề tài: PHƯƠNG PHÁP PCR BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO TRƯỜNGĐẠIHỌCNÔNGLÂMTHÀNHPHỐHỒCHÍMINH KHOATHỦYSẢN Đềtài: PHƯƠNGPHÁP PCR GVHD : LÊ THỊ PHƯƠNG HỒNG 1 1 Thànhviênnhóm NguyễnThịHuỳnhNga 08141029 PhanThịBíchTuyền 08141063 NguyễnMinhQuân 08141123 MaiThịNga 08141105 2MụclụcI. Giới thiệuII. Nguyên tắc PCRIII. Điều kiện phản ứng PCRIV. Quy trình phản ứng PCR1.Giai đoạn biến tính 2.Giai đoạn bắt mồi 3.Giai đoạn kéo dàiV. Ý nghĩa và các ứng dụng PCRVII. Các hạn chế Tài liệu tham khảo 3 GIỚI THIỆU I. PCR ( Polymerase Chain Reaction ) là phản ứng chuỗitrùng hợp hay còn gọi là phản ứng khuếch đại gen“. Trong ngành thủy sản việc áp dụng kỹ thuật PCR đểphát hiện ra các mầm bệnh do virus gây ra như bệnh đốmtrắng,bệnh đầu vàng, hội chứng Taura… trên tôm. 4 II. Nguyên tắc PCR PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi gắn vào 2 sợi đơn của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase. Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. 5 II. Nguyên tắc PCR Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nốitiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: 1 chu kỳ GĐ GĐ GĐ Biến tính Bắt mồi Kéo dài 6III.Điềukiệnphảnứng PCR Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ các thành phần sau : Hình:ThựcnghiệmPCR 71.Nước Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt giới hạn …. 8 2.DungdịchđệmchophảnứngPCR: Thành phần dung dịch đệm thường phụ thuộc vào loạienzyme DNA polymerase sử dụng trong PCR, dung dịchđệm thường chứa muối đệm Tris HCl 10 mM, KCl 50 mMvà MgCl2 1.5 mM Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0.5-5 mM. Chính ionMg2+ gắn kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bámnối của mồi. 93. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs): Deoxyadenosine5’triphosphate 10 3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs): Nồng độ khoảng chừng 100 mM cho mỗi nucleotide:dATP, dCTP, dGTP, dTTP . Nồng độ thấp khoảng 10 – 100 mM thì Taq polymerase cóđộ chính xác cao hơn. 11 4. Mồi (primer) Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA. Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm: Mồi xuôi (forward primer)o Mồi ngược (reverse primer).o 12 5.Enzyme DNA polymerase (Taq) Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A,T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp . Enzyme sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNApolymerase I về sau sử dụng Taq polymerase vì nó không bị pháhủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuốiquá trình phản ứng,có thể chịu nhiệt độ 90 oC lặp lại nhiềulần mà không mất khả năng tổng hợp DNA 13 6. DNA mẫu (DNA template) Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từcác đối tượng nghiên cứu. DNA mẫu có độ nguyên vẹn caotránh lẫn tạp chất. Lượng DNA được sử dụng cũng có khuynh hướng giảm(từ 1mg xuống còn 100µg) vì thế người ta sử dụng polymerasecho hiệu quả cao . 14III.Quytrìnhphảnứng PCR. Trong phản ứng PCR nhiệt độ là vô cùng quan trọng và kèm theo là yếu tố thời gian. Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong một chu kỳ: 15 1. Giai đoạn biến tính: Sợi DNA mạch khuôn bị biến tính tách thành 2 sợi đơn ở nhiệt độ 940C trong vòng 30 giây đến 1 phút . Sự biến tính DNA diễn ra với sự có mặt của hai đoạn mồi và các dNTP. 16 2.Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ thấp xuống từ 50 – 650C tốt nhất là 55oC trong khoảng thời gian 1 – 2 phút . Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase và chiều ...