Định lượng phyllanthin trong diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus L.) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng sử dụng detector huỳnh quang

Bài viết này nghiên cứu với mục đích nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng phyllanthin trong dược liệu Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) sử dụng detector huỳnh quang.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Định lượng phyllanthin trong diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus L.) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng sử dụng detector huỳnh quangTẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018ĐỊNH LƢỢNG PHYLLANTHIN TRONG DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG(Phyllanthus amarus L.) BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNGSỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANGTrần Thu Huyền*; Chử Đức Thành*; Vũ Tuấn Anh*Bùi Thị Bích Vân*; Chử Văn Mến*TÓM TẮTMục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng phyllanthin trong dược liệuDiệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) sử dụngdetector huỳnh quang. Phương pháp: định lượng phyllanthin bằng UPLC kết hợp detectorhuỳnh quang sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH.Kết quả: điều kiện sắc ký gồm: cột C18 (1,6 µm, 2,1 x 50 mm), hệ dung môi acetonitril:nước vớitỷ lệ 55:45 (v/v), tốc độ dòng 0,3 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 2 µl; bước sóng kích thích và phátxạ huỳnh quang 230 và 340 nm; phương pháp được thẩm định với các tiêu chí: tính tươngthích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác. Các tiêu chí đều đápứng yêu cầu của phương pháp định lượng theo quy định. Áp dụng phương pháp phân tích trênmẫu dược liệu Diệp hạ châu đắng xác định được hàm lượng phyllanthin đạt 0,63%. Kết luận:đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng phyllanthin trong Diệp hạ châu đắngbằng UPLC kết hợp detector huỳnh quang.* Từ khóa: Diệp hạ châu đắng; Phyllanthin; Sắc ký lỏng siêu hiệu năng; Huỳnh quang.Quantitative Analysis of Phyllanthin in Phyllanthus Amarus L. usingUltra-performance Liquid Chromatography with Fluorescence DetectorSummaryObjectives: To develop and validate a method for quantitative analysis of phyllanthin inPhyllanthus amarus using ultra-performance liquid chromatography (UPLC) with fluorescencedetector (UPLC-FD). Methods: Quantitative analysis of phyllanthin using UPLC-FD withreversed phase C18 column; the validation of method was in accordance with ICH guideline.Results: The chromatographic condition was developed including C18 column (1.6µm, 2.1 x 50 mm),solvent system including acetonitrile:water with ratio of 55:45 (v/v), flow rate of 0.3 mL/min,injection volume of 2 µL; the excitation and emission wavelengths are 230 and 340 nm ,respectively; the method was validated with system suitability, specificity, linear range, precisionand accuracy. All the parameters were met ICH guideline for method validation. The validatedmethod was then applied for quantitation of phyllanthin in Phyllanthus amarus samples ,the mean content of phyllanthin was 0.63% on dry basis. Conclusion: The quantitative analysismethod of phyllanthin in Phyllanthus amarus using UPLC-FD has been developed and validated.* Keywords: Phyllanthus amarus; Phyllanthin; Ultra-performance liquid chromatography;Fluorescence detection.* Học viện Quân yNgười phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com)Ngày nhận bài: 27/12/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 31/01/2018Ngày bài báo được đăng: 05/03/201826TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018ĐẶT VẤN ĐỀDiệp hạ châu đắng, còn gọi là Chó đẻrăng cưa, Chó đẻ thân xanh, là dược liệuđược trồng, mọc hoang và được sử dụngkhá phổ biến ở Việt Nam với công dụngnhư: thông tiểu, chữa viêm họng, các bệnhgan do virut B [1, 2]. Thành phần hóa họccủa Diệp hạ châu đắng gồm có lignan(phyllanthin, hypophyllanthin) [3] và flavonoid.Phyllanthin là một thành phần chính trongcây Diệp hạ châu đắng có nhiều tác dụngnhư: bảo vệ tế bào gan và ức chế virutviêm gan B [4], chống oxy hóa, làm giảmlượng axít uric trong chứng tăng uric máu,chống viêm [7]. Lữ Thị Kim Chi vàNguyễn Ngọc Vinh đã phân lập và sửdụng phyllanthin làm chất chuẩn đánhdấu cho dược liệu này [4].Có nhiều nghiên cứu định lượngphyllanthin trong Diệp hạ châu đắng bằngsắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp detectorUV và PDA [3, 6, 7, 8]. Tuy nhiên, cácphương pháp này cho giới hạn phát hiệncao và thời gian phân tích mẫu kéo dài.Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hànhxây dựng phương pháp định lượng phyllanthintrong Diệp hạ châu đắng sử dụng UPLCvới detector huỳnh quang giúp rút ngắnthời gian và tăng độ nhạy phân tích.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Hóa chất và thiết bị.* Hóa chất và nguyên liệu:- Chất chuẩn phyllanthin (độ tinh khiết≥ 95%) đạt tiêu chuẩn USP (Hãng SigmaAldrich, Mỹ). Acetonitril, methanol (HãngMerck, Đức). Nước cất đạt tiêu chuẩnphân tích HPLC. Các hóa chất, dung môikhác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.- Diệp hạ châu đắng được thu hái tạikhu vực Ba Vì (Hà Nội) vào tháng 5 - 2017.Mẫu được lưu trữ, xử lý và bảo quản tạiViện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự,Học viện Quân y.* Thiết bị:- Hệ thống máy UPLC UPLC ACQUITYH-Class (Hãng Waters, Mỹ) kết hợp detectorhuỳnh quang FLR ACQUITY (Hãng Waters,Mỹ). Cột sắc ký CORTECS UPLC® BEH C18(1,6 µm, 2,1 x 50 mm) (Hãng Waters, Mỹ).- Cân phân tích MS 205 DU (HãngMettler Toledo, Thụy Sỹ). Tủ sấy UN110(Hãng Memmert, Đức). Bể siêu âm S-450H(Hãng Elma, Đức). Các dụng cụ phân tíchkhác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm.2. Phương pháp nghiên cứu.* Điều kiện sắc ký:Hệ thống phân tích UPLC cao ACQUITYUPLC H-Class với buồng tiêm mẫu tự động,có 4 kênh dung môi, detector huỳnh quang.Thực hiện phân tích trên cột CORTECSUPLC® BEH C18 (1,6 µm, 2,1 x 50 mm),nhiệt độ kiểm soát 300C. Pha động baogồm dung môi A (nước) và dung môi B(acetonitrile) được sử dụng theo chươngtrình rửa giải đẳng dòng, tốc độ rửa giải0,3 ml/phút. Theo dõi sắc đồ ở các bướcsóng 230 và 340 nm trong toàn bộ thí nghiệm,xử lý bằng phần mềm Empower 3.0.* Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử:Chuẩn bị dung dịch chuẩn: hòa tanphyllanthin chuẩn trong methanol đượcdung dịch chuẩn gốc 1,0 mg/ml. Chuẩn bịdung dịch chuẩn làm việc bằng cách phaloãng dung dịch chuẩn gốc tới nồng độthích hợp của chất chuẩn trong methanol.Chuẩn bị mẫu thử [8]: cân chính xác200 mg dược liệu, tiến hành chiết siêu âmvới 5 x 15 ml methanol tro ...