Dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trong tế bào nấm men Pichchia pastoris

Nghiên cứu này có mục tiêu là tạo tái tổ hợp ADN của gen VP28 ở virus trong tế bào nấm men nhằm thu được chủng nấm men có khả năng biểu hiện protein VP28 ngoại bào làm nguyên liệu cho việc điều chế vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trong tế bào nấm men Pichchia pastoris VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 DÒNG HÓA VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ VP28 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRONG TẾ BÀO NẤM MEN PICHCHIA PASTORIS Ngô Thị Ngọc Thủy1, Nguyễn Viết Dũng2, Đặng Thị Trà My1 TÓM TẮT Virus gây bệnh đốm trắng là loại virus phổ biến và là một trong những nguyên nhân gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm he trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Nghiên cứu này có mục tiêu là tạo tái tổ hợp ADN của gen VP28 ở virus trong tế bào nấm men nhằm thu được chủng nấm men có khả năng biểu hiện protein VP28 ngoại bào làm nguyên liệu cho việc điều chế vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi. Đoạn gen VP28 đã được khuếch đại bằng kỹ thuật Polymerase chain reaction; sản phẩm khuếch đại sau đó được dòng hóa vào vector pPIC9K để tạo tái tổ hợp pPIC9K-VP28 rồi pPIC9K-VP28 được biến nạp vào tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 để biểu hiện protein mục tiêu và cảm ứng biểu hiện bằng methanol. Quá trình sàng lọc 200 chủng nấm men sau biến nạp đã được thực hiện. Kết quả thu được 5 chủng nấm men có mang pPICK9K- VP28 có khả năng cảm ứng biểu hiện protein VP28 ngoại bào. Áp dụng phương pháp Bradford để đo nồng độ protein ngoại bào của 5 chủng nghiên cứu theo thời gian lên men P. pastoris và lượng protein tổng số cao nhất sau 72 giờ nuôi cấy là 106,9 μg/ml. Từ khóa: Pichia pastoris, protein, VP28, WSSV I. MỞ ĐẦU bằng chất kích thích miễn dịch và đặc biệt bằng Virus gây hội chứng đốm trắng (White spot protein/DNA tái tổ hợp (vắc xin/tolerine),... đã syndrome virus - WSSV) xuất hiện đầu tiên thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu năm 1992 tại Trung Quốc (Chou và ctv, 1995) nhất là sau khi hiện tượng “đáp ứng miễn dịch” là loại virus gây bệnh nghiêm trọng và phổ biến (quasi-immune response) trên tôm (Venegas và nhất cho các loài tôm he. Ở Việt Nam, virus ctv, 2000) được công bố. này được phát hiện năm 1993 và từ đó đến nay Việc sử dụng kỹ thuật tạo protein DNA tái chúng luôn là một trong những nguyên nhân tổ hợp đã được nghiên cứu ở Việt Nam với mục chủ yếu gây thiệt hại kinh tế lớn cho nghề nuôi tiêu phát triển kháng thể đa dòng trong chẩn tôm. Theo cục Thú y, Bộ Nông nghiệp và Phát đoán bệnh đốm trắng (Nguyễn Quỳnh Anh triển Nông thôn, năm 2012, bệnh đốm trắng đã 2006; Bùi Thị Bích Hằng, 2012). Tuy nhiên, xuất hiện ở vùng nuôi tôm của 19 tỉnh thành chưa có nghiên cứu nào ứng dụng kỹ thuật này trên cả nước với tổng diện tích bệnh là 8.108,5 trong việc nghiên cứu chế tạo vắc xin/tolerine ha. Bảy tháng đầu năm 2013, dịch bệnh đốm phòng bệnh đốm trắng trên tôm. Nghiên cứu trắng đã xuất hiện và lây lan nhanh tại 23 tỉnh này là một phần của đề tài cấp Bộ: “Bước đầu với tổng diện tích bệnh là 7.030 ha. Nhằm giảm nghiên cứu, sản xuất tolerin có khả năng hạn thiểu thiệt hại do dịch bệnh đốm trắng gây ra, chế lây lan của virus gây bệnh đốm trắng trên các biện pháp phòng bệnh bằng thảo dược, tôm Sú nuôi thương phẩm ở Đồng bằng sông 1 Phân Viện Nghiên cứu Thuỷ sản Minh Hải, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 Email: thuyngo8@yahoo.com 2 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014 79 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Cửu Long” sẽ thực hiện việc dòng hóa và biểu Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng cách hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây sử dụng bộ kit PCR purification (Invitrogen) và bệnh đốm trắng trong tế bào nấm men để làm thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. nguyên liệu cho việc chế tạo vắc xin/tolerine  Tinh sạch plasmid pPICK9K phòng bệnh cho tôm. Plasmid pPIC9K trong vi khuẩn E. coli II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP DH5α được tinh sạch bằng bộ kit Wizard® NGHIÊN CỨU Plus SV Minipreps DNA Purification (A1330, 2.1. Vật liệu nghiên cứu Promega, Mỹ). Cụ thể, một khuẩn lạc E. coli Chủng virus đốm trắng được sử dụng DH5α mang vector pPIC9K trên môi trường trong nghiên cứu này là chủng thu được tại LB có ampicilin được chọn và nuôi sinh khối tỉnh Quảng Ngãi trong thời gian dịch bệnh; là trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilin loại virus đã dùng trong nghiên cứu của Dieu (100µg/ml), nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) ở (2010) được cung cấp bởi trường Đại học 37°C; sinh khối thu sau 18-24 giờ nuôi cấy. Sau Wageningen, Hà Lan. đó, plasmid pPIC9K trong sinh khối vi khuẩn nuôi cấy được tinh sạch bằng kit theo hướng 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu dẫn của nhà sản xuất. Plasmid tinh sạch được Công việc được tiến hành tại Viện Nghiên bảo quản ở -20°C. cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 từ tháng 4/2013 đến  Xử lý DNA VP28 và plasmid đã tinh sạch tháng 12/2013. bằng enzyme cắt giới hạn 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...