GIẢI TRÌNH TỰ DNA

Dựa trên nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạo sợi bổ sung từ mồi cho sợi khuôn, nhưng do trong ống phản ứng có thêm các ddNTP, nên mỗi khi men polymerase kéo nhầm ddNTP vào thì sợi bổ sung sẽ bị chặn lại và kết quả là sẽ có các sợi bổ sung với độ dài khác nhau.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
GIẢI TRÌNH TỰ DNAGIẢI TRÌNH TỰ DNA DNA SEQUENCING TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy 1. GIẢI TRÌNH TỰ DNAGiải trình tự DNA là một thí nghiệm cho kếtquả thứ tự sắp xếp các nucleotide trongđoạn DNA đó.Vd:5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGGTCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACGCTTAATAGAACAANAAA3’2. HAI PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNAPhương pháp hoá học giải trình tự DNA của Maxam & Guilbert (1977) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự) Walter GilbertPhương pháp enzyme giải trình tự của Frederick Sanger (1977) Nobel hoá học 1958 (cấu trúc protein: Insulin) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)2.1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HÓA HỌC 1. Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P). 2. Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu 32P bằng hóa chất làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA3. Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính Autoradiography2.2. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP ENZYMDựa trên nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạosợi bổ sung từ mồi cho sợi khuôn, nhưng do trongống phản ứng có thêm các ddNTP, nên mỗi khi menpolymerase kéo nhầm ddNTP vào thì sợi bổ sung sẽbị chặn lại và kết quả là sẽ có các sợi bổ sung với độ dài khác nhau. dNTP ddNTP Mồi được đánh dấuBốn phản ứng polymer hoá Tỉ lệ dNTP và ddNTPxảy ra trong 4 ống riêng = 100 : 1biệt MỒI ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ P35 A C G T T 3’ C G C A G T C C T A G C T Sequence 5’ to 3’ T AC GG CG GG G 5’CG Áp gel điện di lên phim (mồi đánh dấu bằngT phóng xạ hay bằng hoá quang), các vạch điện di trên gel sẽ hiện trên phim.ĐÁNH DẤU ddNTP 1. Gắn ddNTP ngẫu nhiên, khi xẩy ra, p/ứng ngừng. 2. Vì nhiều copy của Sequence-specific primer DNA đích được tạo đồng thời, nên các sản phẩm DNA được tổng hợp mới của tất cả các kích thước đều hiện diện với tận cùng là các ddNTP GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN1. Dùng gel polyacrylamide biến tính, có độ phân giải cao, có thể phân biệt các đoạn DNA khác nhau chỉ 1 nucleotid.2. Gel polyacrylamide thường chứa urea (tác nhân làm biến tính DNA) 3. KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰBước 1: Tinh sạch sản phẩm PCR PCR clea nup Sản phẩm PCR Ontosequencing…. Sản phẩm PCR tinh sạchPCR + nước+ DNA đích+ Taq polymerase+ Mồi và dNTPs Đo nồng độ DNA bằng máy+ PCR buffer, etc…. hay ước lượng qua điện di Bước 2: Phản ứng chu kỳ giải trình tự (cycle sequencing reaction) denaturation Product extension PrimerannealingPCR machine Tủa sản phẩm giải trình tự loại bỏ chất đánh dấu thừa Bước 3: Điện di trên máy giải trình tự1. Mỗi ddNTP được gắn một màu khác nhau.2. Sản phẩm PCR được phân loại dựa trên kích thước (khác nhau 1 nt), khi chạy qua khu vực phát hiện sẽ được phân tích nhờ chùm tia laser và bộ phận detector.3. Dữ liệu được ghi nhận gồm cường độ huỳnh quang thu được và màu sắc của mỗi đoạn DNA.4. Trình tự của đoạn DNA được đọc theo chiều 5’ đến 3’, từ trái sang phải.Automated DNA Sequencing with Fluorescent Dyes Mỗi ddNTP có một màu khác nhau, ddTTP đỏ, ddGTP đen,… 4. HIỆU QUẢ P/ỨNG GIẢI TRÌNH TỰ1. Tối ưu hóa phản ứng PCR phải thật sự hoàn chỉnh2. Chất lượng và nồng độ DNA đích3. Mồi đặc hiện với nồng độ thích hợp4. Sản phẩm PCR phải tinh sạch5. Phải xác định đúng hàm lượng mồi và sản phẩm PCR tinh sạch cho p/ứng chu kỳ giải trình tựHệ thống giải trình tự Trugene Siemens Medical Solutions Diagnostics ...