Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 4

Chương 4: ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬTóm tắt: Enzyme là những protein hoạt tính sinh học vả dựa vào loại phản ứng xúc tác mà trong sinh học phân tử có thể chia enzyme thành 6 nhóm khác nhau. Trong đó các nhóm enzyme giới hạn, enzyme polimerase, enzyme nối, các enzyme nuclease được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực của sinh học phân tử và kĩ thuật di truyền. Enzyme được sử dụng trong các kĩ thuật sinh học phân tử như RFLP, PCR, tách dòng phân tử......... Nội...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 4Chương 4: ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌCPHÂN TỬTóm tắt: Enzyme là những protein hoạt tính sinh học vả dựa vào loại phản ứngxúc tác mà trong sinh học phân tử có thể chia enzyme thành 6 nhóm khác nhau.Trong đó các nhóm enzyme giới hạn, enzyme polimerase, enzyme nối, cácenzyme nuclease được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực củasinh học phân tử và kĩ thuật di truyền. Enzyme được sử dụng trong các kĩ thuậtsinh học phân tử như RFLP, PCR, tách dòng phân tử.........Nội dung của chương gồm 3 vấn đề cơ bản: (1). Enzyme giới hạn, (2). cácnhóm enzyme khác; (3). Enzyme nuctease. Hệ thống enzyme có thể chia thành 6 nhóm tuỳ theo loại hình phản ứngmà các enzyme này xúc tác. Nhóm enzyme nuclease có tác dụng cắt và phá huỷADN, nhóm ADN-ligase có chức năng nối các trình tự ADN lại. nhóm enzymeADN-polimerase tham gia tổng hợp chuỗi polinucleotit, nhóm enzyme ADN-polimerase sửa chữa có chức năng sửa chữa những sai sót trong phân tử ADN,nhóm enzyme topoisommerase tác dụng mở xoắn ADN, nhóm enzyme phiên mãngược reverse-transcriptase xúc tác cho quá trình phiên mã ngược từ ARN thànhcADN. Các nhóm enzyme trên có vai trò hết sức quan trọng trong các thao tácvới ADN và trong công nghệ ADN tái tổ hợp. Trong số đó có các nhóm enzymegiới hạn, enzyme sửa chữa ADN, ADN-polimease, ADN-ligase....§1. ENYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME HOẶC ENZYME CẮTHẠN CHẾ (RESTRICTION ENDONUCLEASE - RE)1.1. Khái niệm Nhóm enzyme nuclease gồm DN-ase và RN-ase có khả năng bẻ gãy liênkết phosphodiester kết quả là phân huỷ phân tử ADN hoặc ARN. Nhóm enzyme ADN-ase gồm 2 loại: Exonuclease (enzyme cắt ADNngoại bào) có tác dụng cắt từng cặp nucleotit từ hai đầu của đoạn ADN đi dầnvào bên trong (hình 4.1). Enzyme exonuclease có thể cắt tỉa từng cặp nucleotit ởcả hai mạch (cắt kép) hoặc cắt từng nucleotit trên một sợi ADN (cắt đơn).Endonuclease (enzyme cắt ADN nội bào) có tác dụng cắt rời ADN tại nhữngvùng xác định gồm vài cặp nucleotit nằm cạnh nhau định vị trong phân tử ADN,tạo thành những phân đoạn ADN nhỏ hơn. Enzyme endonuclease có thể cắt đơn 50hoặc cắt kép (hình 4.1). Hình 4.1. Đặc điểm cắt của exonuclease và endonuclease Một loại enzyme endonuclease có thể nhận biết vị trí nhất định bên trongphân tử ADN và cắt đặc hiệu, cắt một lần tại một điểm đó. Những kết luận trênđã được phát hiện trong thập kỉ 60 của thế kỉ XX. Trong những thí nghiệm ở vikhuẩn người ta đã phát hiện một nhóm các enzyme có thể nhận biết và phân cắtphân tử ADN của phagơ khi ADN ngoại lai này bảo vệ tế bào chủ xâm nhập.Các enzyme này bảo vệ tế bào chủ khỏi bị nhiễm phagơ - đó là các enzyme giớihạn. Enzyme cắt hạn chế (enzyme giới hạn) là loại enzyme nuclease có khảnăng nhận biết được điểm cắt và cắt tại điểm xác định. Tuy nhiên vấn đề đặt ralà, liệu enzyme giới hạn cắt ADN của chính tế bào chủ? Những nghiên cứu chothấy các enzyme giới hạn phân huỷ bất kì ADN ngoại lai nào xâm nhập vào tếbào; trong tế bào hệ thống enzyme sửa đổi (methylase) sửa đổi ADN tế bào chủbằng cách methyl hoá các bazơ xác định của đoạn trình tự nhận biết, nhờ vậyngăn cản enzyme giới hạn cắt vào ADN của tế bào chủ.Những enzyme này là đại diện của một trong các nhóm enzyme quan trọng nhất 51dùng trong thao tác ADN.1.2. Các nhóm enzyme giới hạn Các enzyme giới hạn có ba nhóm I, II, III và các enzyme giới hạn đượcdùng phổ biến ngày nay thuộc nhóm II. Enzyme giới hạn nhóm II có cơ chế tácđộng đơn giản nhất, chúng là các nuclease, và vì chúng cắt tại một vị trí nằm bêntrong sợi ADN và không phân huỷ ADN từ hai đầu, nên gọi là endonuclease.Bảng 4.1. Đặc điểm của các loại enzyme giới hạn Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm IIIĐiểm cắt Xa điểm nhận biết Nằm trong điểm Nằm ngoài điểm hơn 1000 bp nhận biết nhận biết nhận biếtKhả năng methy hóa gốc Có Không CóAdenine ATP,Mg++, Mg++ Mg++ hoặc Mn++ Mg++, S-AdoMetĐiều kiện để cắt S-AdoMetCấu trúc của enzyme (số Khác nhau Giống nhau Khác nhauchuỗi polipeptide) Hình 4.2. Quá trình methyl hoá bởi enzyme methylase Cách gọi tên các enzyme giới hạn dựa trên các quy ước quốc tế. Tên chivà tên loài của sinh vật, mà ở đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần 52đầu của tên enzyme, phần đó gồm chữ thứ nhất của tên chi và hai chữ đầu củatên loài. Chẳng hạn enzyme tách chiết được từ một nòi của Escherichia coli thìđặt tên là Eco, còn enzyme tách từ Bacillus amiloliquefaciens thì gọi là Bam...Hai loại enz ...