Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 9

Chương 9 PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE Tóm tắt: Công nghệ ADN tái tổ hợp bao gồm các kĩ thuật tách dòng gene và biểu hiện gene. Bắt đầu từ sự phân lập gene và sau đó là tạo vector tái tổ hợp, biến nạp vào tế bào chủ, tách dòng và xác định trình tự gene. Protein là sản phẩm biểu hiện gene. Quá trình biểu hiện gene ngoại lai bắt đầu từ việc đưa gene vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào chủ. Vector biểu hiện gene được thiết kế...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 9 Chương 9 PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE Tóm tắt: Công nghệ ADN tái tổ hợp bao gồm các kĩ thuật tách dòng gene và biểu hiện gene. Bắt đầu từ sự phân lập gene và sau đó là tạo vector tái tổ hợp, biến nạp vào tế bào chủ, tách dòng và xác định trình tự gene. Protein là sản phẩm biểu hiện gene. Quá trình biểu hiện gene ngoại lai bắt đầu từ việc đưa gene vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào chủ. Vector biểu hiện gene được thiết kế bao gồm promotor mạnh và điều khiển được. E. coli là vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp và sự biểu hiện gene thành công nhất hiện nay vẫn là ở E. coli. Phân lập, tách dòng và biểu hiện gene được minh hoạ bằng ví dụ về sự phân lập, xác định trình tự gene mã hoá cho trichobakin-RIP và quá trình biểu hiện gene này. Nội dung của chương gồm 3 vấn đề chính là: (1).Phân lập gene; (2). Tách dòng gene; (3). Biểu hiện gene. §1. PHÂN LẬP GENE Phân lập gene hay phân lập đoạn ADN theo mục đích có thể được tiến hành theo phương pháp sử dụng enzyme cắt hạn chế hoặc bằng phản ứng chuỗi PCR. Phân lập gene mang ý nghĩa trong kĩ thuật giải trình tự ADN hay tạo dòng ADN tái tổ hợp trong kĩ thuật chuyển gene. 1.1. Phân lập gene bằng kĩ thuật cắt hạn chế Enzyme giới hạn (restrition enzyme) có khả năng cắt ADN ở những điểm đặc hiệu. Với đặc tính đó người ta đã vận dụng để xác định những đoạn ADN mã hoá cho các tính trạng của sinh vật và phân lập đoạn ADN đó. Kĩ thuật phân lập gene nhờ enzyme giới hạn có thể gồm các bước sau: (1). Tách chiết và tinh sạch ADN. (2). Cắt ADN bởi enzyme giới hạn. (3). Điện di trên gel agarose. (4). Dựa vào ADN marker xác định được đoạn ADN cần phân lập. (5). Biến tính ADN thành 2 mạch đơn ngay trên gel, rồi chuyển lên màng 126 lai phân tử. Vị trí các đoạn ADN được giữ nguyên. (6). ADN cố định trên màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Rửa để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp. (7). Dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai ADN- mẫu dò. 1.2. Phân lập gene bằng kĩ thuật PCR Phản ứng chuỗi polimerase được tiến hành với các primers có trình tự biết trước. Cặp primer gồm primer xuôi (sens primer) và ngược (antisens primer) được thiết kế theo trình tự gene từ ngân hàng gene. Cặp mồi chuyên biệt này được bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN. Sử dụng cặp mồi chuyên biệt cùng với ADN mẫu, enzyme, dNTP, Mg++, bufpher... trong thiết bị nhân ADN (máy PCR) thì đoạn gene từ phân tử ADN mẫu sẽ được khuếch đại. Phân lập gene bằng PCR có thể được tiến hành theo các bước sau: (1) Tách chiết và tinh sạch ADN. (2). Thiết kế primers. (3). Chọn điều kiện phản ứng PCR. (4). Nhân đoạn ADN trong máy PCR để phân lập đoạn gene theo mục đích. §2. TÁCH DÒNG GENE 2.1. Mục đích - Tạo ra một lượng lớn bản sao một trình tự ADN xác định. - Chọn lọc một thư viện gene. 2.2. Các bước của kĩ thuật tách dòng - Chọn và xử lí vector. - Xử lí ADN cần tạo dòng. - Tạo vector tái tổ hợp. - Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. - Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gene. 127 Hình 9.1. Quy trinh chung của kĩ thuật tách dòng gene 2.3. Thư viện bộ gene Thư viện bộ gene là tập hợp tất cả các trình tự ADN cấu thành bộ gene đã được gắn vào vector. Về nguyên tắc, thư viện bộ gene được thiết lập từ bất cứ tế bào nào của sinh vật nghiên cứu. Các bước thiết lập thư viện bộ gene: (1) Tách chiết ADN. (2). Cắt ADN thành những đoạn có kích thước xác định bằng RF. (3). Gắn đoạn các ADN vào vector để tạo vector tái tổ hợp. (4). Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. (5). Tế bào chủ nuôi cấy trên môi trường đặc và hình thành nên các dòng. 128 Hình 9.2. Tách dòng ADN tái tổ hợp Ứng dụng: - Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gene, đặc biệt cấu trúc itron, exon của một gene xác định. - Tạo dòng các trình tự không mã hoá nằm cạnh các gene và đóng vai trò quyết định trong sự điều hoà biểu hiện gene. 2.4. Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gene chaperonin ở đậu tương Một ví dụ về xác định trình tự gene chaperonin liên quan đến tính chịu nóng hạn ở cây đậu tương Glicine max (L.) Merrill trên thiết bị tự động theo 129 nguyên tắc của phương pháp Sanger. Glicine max (L.) Merrill là loại cây trồng có vị trí quan trọng hàng đầu trong các loại cây họ đậu. Hạt đậu tương có hàm lượng protein cao từ 28% - 45%, dễ tan và chứa hầu hết các loại axit amin, đặc biệt là các loại axit amin không thay ...