Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự gen và Real - Time PCR

Giải trình tự gen là tìm ra trình tự sắp xếp củacác nucleotides trên đoạn gen được quan tâmnhằm phát hiện sự đột biến gen hoặc để thiết kếgen mồi (primer) và các vector tách dòng(cloning) nhằm tạo ra các protein tái tổ hợp có giátrị cao trong Y học (vaccine, thuốc chữa bệnh,các sinh phẩm phục vụ chẩn đoán bệnh hoặcnghiên cứu khoa học…).Kỹ thuật giải trình tự gen được công bố năm1975 bởi Sanger (nguyên lý enzym) và Maxam -Gilbert năm 1977 (nguyên lý phân giải hoá học).Hiện nay, các kỹ thuật này đã được cải tiến rấtnhiều...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự gen và Real - Time PCR TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004 Giíi thiÖu kü thuËt gi¶i tr×nh tù gen vµ Real - Time PCR Lª V¨n Phñng* Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi 1. Kü thuËt gi¶i tr×nh tù gen §Ó gi¶i tr×nh tù ®−îc gen FliC, b−íc ®Çu tiªn Gi¶i tr×nh tù gen lµ t×m ra tr×nh tù s¾p xÕp cña lµ ph¶i thiÕt kÕ cÆp måi ®Æc hiÖu. CÆp måi nµy ®·c¸c nucleotides trªn ®o¹n gen ®−îc quan t©m ®−îc thiÕt kÕ t¹i Labo trung t©m Y Sinh häc, ®−îcnh»m ph¸t hiÖn sù ®ét biÕn gen hoÆc ®Ó thiÕt kÕ ®Æt tªn lµ FliC_b_seqF (aag cgg cta ttt cgc cgc cgen måi (primer) vµ c¸c vector t¸ch dßng = 19 nucleotides) vµ FliC_b_SeqR (cgt gtc ggt(cloning) nh»m t¹o ra c¸c protein t¸i tæ hîp cã gi¸ gaa tca atc gc = 20 nucleotides). C¸c tr×nh tù nµytrÞ cao trong Y häc (vaccine, thuèc ch÷a bÖnh, ®· ®−îc göi ®i tæng hîp thµnh c¸c olignucleotidec¸c sinh phÈm phôc vô chÈn ®o¸n bÖnh hoÆc t¹i C«ng ty Invitrogen (Hång K«ng). §Ó thiÕt kÕnghiªn cøu khoa häc…). ®−îc c¸c cÆp måi nµy, c¸c th«ng tin vÒ gen FliC Kü thuËt gi¶i tr×nh tù gen ®−îc c«ng bè n¨m ph¶i ®−îc thu thËp tr−íc trªn c¸c ng©n hµng d÷1975 bëi Sanger (nguyªn lý enzym) vµ Maxam - liÖu gen (GenBank hoÆc EMBL ch¼ng h¹n).Gilbert n¨m 1977 (nguyªn lý ph©n gi¶i ho¸ häc). B−íc thø hai lµ t¸ch chiÕt ADN tõ c¸c chñngHiÖn nay, c¸c kü thuËt nµy ®· ®−îc c¶i tiÕn rÊt Salmonella, c¸c ADN nµy sÏ dïng lµm khu«nnhiÒu nhê nh÷ng tiÕn bé míi vÒ khoa häc vµ c«ng trong ph¶n øng PCR ë b−íc tiÕp theo. Qu¸ tr×nhnghÖ (Ho¸ häc, VËt lý, §iÖn tö vµ C«ng nghÖ t¸ch chiÕt nµy kh«ng khã, c¸c Labo sinh häcth«ng tin), lµm cho hiÖu suÊt cña viÖc gi¶i tr×nh tù ph©n tö ®Òu cã th−êng quy nµy.gen ngµy mét cao; ng−êi ta cã thÓ gi¶i mét tr×nh B−íc thø ba lµ ch¹y PCR lÇn 1 víi cÆp måi vµtù dµi hµng ngh×n cÆp base chØ trong vßng vµi ADN khu«n nãi trªn. §iÒu kiÖn tèi −u cho ph¶ntiÕng ®ång hå, ®iÒu mµ tr−íc ®©y ph¶i lµm hµng øng PCR nµy ph¶i dß t×m, nÕu m¸y PCR cãtuÇn. ch−¬ng tr×nh Gradient th× viÖc t×m kiÕm c¸c ®iÒu Cã nhiÒu kü thuËt gi¶i tr×nh tù gen, sau ®©y kiÖn nhiÖt ®é tèi −u sÏ thuËn lîi h¬n nhiÒu.xin giíi thiÖu mét kü thuËt hiÖn nay ®ang ®−îc ¸p B−íc thø t− lµ tinh s¹ch s¶n phÈm cña ph¶ndông phæ biÕn th«ng qua mét vÝ dô cô thÓ, gi¶i øng PCR nãi trªn. Cã thÓ dïng ph−¬ng ph¸p t¸chm· gen FliC. b¨ng ADN ®Æc hiÖu ngay trªn th¹ch ®iÖn di (rÎ Gen FliC lµ gen m· ho¸ cho kh¸ng nguyªn tiÒn) hoÆc dïng KIT th−¬ng m¹i (®¾t h¬n).l«ng (protein) pha I cña vi khuÈn Salmonella. C¸c B−íc thø n¨m lµ ch¹y PCR lÇn hai. Kh¸c víiSalmonella cã l«ng th× ®Òu cã kh¸ng nguyªn nµy, PCR lÇn 1, lÇn nµy trong hçn hîp ph¶n øng,nh−ng tÝnh ®Æc hiÖu th× kh¸c nhau ë mçi loµi. Sù ng−êi ta cho thªm dideoxynucleosidekh¸c nhau nµy lµ do m· ho¸ kh¸c nhau (tr×nh tù triphosphate (hai vÞ trÝ, trong ®ã cã vÞ trÝ 3’,c¸c nucleotides kh¸c nhau) ë gen FliC quy ®Þnh. kh«ng cã nhãm OH - ) cã g¾n chÊt mµu huónhChÝnh v× vËy, gi¶i ®−îc tr×nh tù gen FliC sÏ cho quang. HiÖn nay, kü thuËt ®· cho phÐp g¾n c¸cphÐp thiÕt kÕ ®−îc c¸c gen måi ®Æc hiÖu cho tõng chÊt mµu huónh quang kh¸c nhau trªn 4 lo¹iloµi Salmonella nh»m ph¸t triÓn c¸c kü thuËt sinh nucleotide nµy, v× vËy, chØ cÇn lµm mét ph¶n ønghäc ph©n tö (ch¼ng h¹n PCR) ®Ó chÈn ®o¸n ®Æc PCR trong mét èng duy nhÊt chung cho c¶ 4 lo¹ihiÖu cho tõng loµi hoÆc phôc vô cho c¸c nghiªn nucleotide (A, C, G vµ T); so víi tr−íc ®©y ph¶icøu t×m kiÕm vaccine cã ®é ®Æc hiÖu vµ c«ng hiÖu lµm 4 ph¶n øng riªng rÏ ë 4 èng.cao. * PGS. TS. Tr−ëng Labo trung t©m, Phã chñ nhiÖm Bé m«n Vi sinh vËt - Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi.26 TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004 B−íc thø s¸u lµ lµm tinh s¹ch s¶n phÈm KÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh gi¶i tr×nh tù gen FliC (ADN) cña ph¶n øng PCR 2 vµ lµm biÕn tÝnh ®−îc l−u trong m¸y d−íi hai d¹ng (h×nh ¶nh vµ chóng ®Ó t¹o ra ADN sîi ®¬n duçi th¼ng. ch÷). KÕt qu¶ nµy ®· ®−îc so s¸nh víi c¸c d÷ liÖu B−íc thø b¶y lµ ®−a ADN ®· ®−îc xö lý vµo cïng lo¹i cã trong ng©n hµng gen (GenBank, m¸y gi¶i tr×nh tù gen ®Ó ®äc tù ®éng tr×nh tù c¸c www. ncbi. nlm. nih. gov) vµ ®· ®−îc ®¨ng ký vµ nucleotide trªn FliC. Cã thÓ chØ ®äc mét sîi hoÆc c«ng bè chÝnh thøc víi sè truy cËp lµ AY657000 ®äc ®ång thêi c¶ hai sîi ®Ó t¨ng ®é chÝnh x¸c cña vµ AY657001. Sau ®©y xin g ...