Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật (5)

Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật (5) Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật (tt)5. Một số phương pháp phổ biếnsử dụng trong bảo quản các nhómvi sinh vật cụ thể: Trong phần này chúng tôigiới thiệu cụ thể một số phươngpháp thông dụng nhất.5.1. Các phương pháp dùng chobảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn: Bảo quản vi khuẩn: a. Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization): Đây là phương pháp phổ biếnđược sử dụng tại mọi bảo tàng visinh vật trên thế giới. Phương phápđông khô hạn chế được sự thay đổicác đặc tính của vi sinh vật và bảoquản được trong một thời gian dài. Phương pháp đông khô đượctrình bày ở đây là phương phápđược dùng tại NCTC (NationalColleciton Type Culture, Anh). 1, Nuôi vi khuẩn cho đôngkhô: Vi khuẩn được cấy trên môitrường ống thạch nghiêng thíchhợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩnbị dịch vi khuẩn trên môi trườngdịch thể nhưng phải làm đậm đặc tếbào bằng li tâm. Tuổi của tế bàocũng rất quan trọng do đó thườngchọn tế bào nằm trong pha sinhtrưởng log. 2, Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng một trong hailoại đệm sau: + Đệm huyết thanh- inositol; Meso-inositol: 5 gam Huyết thanh ngựa (số3): 100 ml Thanh trùng bằngphương pháp lọc vi khuẩn, sau đóphân 5ml vào các bình vô trùng. + Đệm inositol: Môi trường dinh dưỡng bột số2: 2.5 gam Meso-inositol: 5 gam Nước cất: đủ 100 ml. Phân 5 ml vào các bình vàkhử trùng tại nhiệt độ 121OC. 3, Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quantrọng đối với chất lượng bảo quản.Thông thường có thể thu sinh khốitừ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùngcho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạodịch huyền phù tế bào. Mật độ vikhuẩn thông thường cần đạt1010 (đối với vi sinh vật không cóbào tử). Mật độ trên có thể giảmvới các vi sinh vật có bào tử. Haiđệm pha mẫu trên có thể dùng vớimọi vi khuẩn nhưng trong trườnghợp enterobacteria thì không dùngđệm huyết thanh vì sẽ gây ra thayđổi đặc tính miễn dịch của vikhuẩn. 4, Chuẩn bị ống đông khô: Ống đông khô được rửa sạchsau đó ngâm qua đệm với dịch acidloãng (HCl 2%) và lại được rửasạch, làm khô và chuẩn bị nútbông, ống được thanh trùng khôhoặc khử trùng theo phương phápthông thường. 5, Chuẩn bị mẫu trước khiđông khô: Lượng dịch huyền phù vikhuẩn được đưa cẩn thận bằngpipet pasteur vào ống đông khôkhoảng 0.1- 0.2 ml. Chú ý mọi thaotác phải cẩn thận tránh dính mẫuvào thành hay phía trên của ốngđông khô. 6, Bước tiền đông khô: Mục tiêu của bước này là làmbay hơi hết nước có thể bị lạnhđông tạo đá. Trước khi tiến hànhđông khô mẫu được chuẩn bị quabước tiền đông (như trình bày ởtrên) sau đó bước tiền đông khôtiến hành khi mẫu được lắp vào hệthống đông khô và quá trình làmmất nước trong điều kiện lạnh đượctiến hành khoảng 3 giờ. 7, Tạo chỗ thắt trên ốngđông khô: Sau bước tiền đông khô, yêucầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vếtthắt được thực hiện với hệ thốngđèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay cáccơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụnghệ thống hàn và tạo vết thắt trênthiết bị tự động. 8, Hậu đông khô: Trong bước này mẫu lại tiếptục được làm khô cho đến độ ẩmcuối cùng đạt khoảng 1%. Thờigian cho bước này có thể thay đổitừ 1-2 giờ. 9, Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp trênthiết bị đông khô (manifold) cần cókinh nghiệm và cẩn thận. Trước hếtphải tiến hành khoá van và sau đómới thực hiện thao tác hàn ốngđông khô. 10, Kiểm tra độ chân khôngcủa ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị làđèn phát hiện mức độ chân không.Với các mẫu đạt độ chân không cầnthiết thì xuất hiện màu xanh tímnhạt. Đối với các mẫu không đạttiêu chuẩn thì không có tín hiệuhoặc màu tím đậm. 11, Kiểm tra khả năng sốngcủa mẫu: Đếm số lượng tế bào làphương pháp chủ yếu để đánh giáchất lượng bảo quản. Việc đếmđược thực hiện trước khi và ngaysau khi đông khô. Các bước kiểmtra tiếp theo có thể được thực hiệnsau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chấtlượng của mẫu đông khô. Nóichung khả năng sống của vi sinhvật có bào tử cao hơn vi sinh vậtkhông có bào tử và loại gramdương cao hơn vi sinh vật gramâm. Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵkhí thì yêu cầu phải được tiến hànhtheo đúng qui trình, tránh vi sinhvật tiếp xúc với oxy. 12, Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường được bảo Oquản tại 4 C hay nhiệt độ phòng. b. Phương pháp giữ trong lạnh sâu: 1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trênmôi trường và nhiệt độ thích hợpnhất tại giữa hoặc đầu pha log. 2, Pha dịch tế bào vớiglycerol hoặc DMSO đã thanhtrùng trước để đạt nồng độ cuốicùng 10% và mật độ tế bào 106. 3, Dịch huyền phù tế bàođược đưa vào ống lạnh sâu và đóngnắp (trong trường hợp hàn ống thuỷtinh, cần để trong dịch xanhmetylene 0.05% để phát hiện cácống bị rò rỉ). Toàn bộ mẫu để ở nhi ...