Khác biệt trong sự mẫn cảm với Novirhabdo virus của Zebrafish dòng hoang dại và đột biến và vai trò của Lymphocytes

Để nghiên cứu sự đóng góp của miễn dịch sơ cấp và lymphocyte dựa trên miễn dịch kháng lại virus nhiễm trên cá, hai dòng zebrafish hoang dại (wild-type) và đột biến (Rag1 mutant, không có tế bào lymphocyte T và B) được cảm nhiễm với Snakehead Rhabdovirus (SHRV), thuộc novirhabdovirus, bằng cách tiêm xoang bụng (IP) vào cá ở các độ tuổi khác nhau và nhiệt độ khác nhau.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Khác biệt trong sự mẫn cảm với Novirhabdo virus của Zebrafish dòng hoang dại và đột biến và vai trò của Lymphocytes VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II KHÁC BIỆT TRONG SỰ MẪN CẢM VỚI NOVIRHABDO VIRUS CỦA ZEBRAFISH DÒNG HOANG DẠI VÀ ĐỘT BIẾN VÀ VAI TRÒ CỦA LYMPHOCYTES Nguyễn Ngọc Du1*, Lorelei Ford2, Lora Petri- Hanson2, Larry Hanson2 TÓM TẮT Để nghiên cứu sự đóng góp của miễn dịch sơ cấp và lymphocyte dựa trên miễn dịch kháng lại virus nhiễm trên cá, hai dòng zebrafish hoang dại (wild-type) và đột biến (Rag1 mutant, không có tế bào lymphocyte T và B) được cảm nhiễm với Snakehead Rhabdovirus (SHRV), thuộc novirhabdovirus, bằng cách tiêm xoang bụng (IP) vào cá ở các độ tuổi khác nhau và nhiệt độ khác nhau. Cả hai dòng đều mẫn cảm cao với SHRV. Cá bệnh có biểu hiện lồi mắt, xuất huyết gốc vây và thân, vảy dựng. Dòng hoang dại có sự mẫn cảm với virus giảm dần theo độ tuổi. Cá ở 2 tháng tuổi chết nhiều hơn cá 4 và 7 tháng tuổi khi cho cảm nhiễm với virus. Nhiệt độ cũng gây ảnh hưởng quan trọng trong sự mẫn cảm của chủng hoang dại. Ở 24°C, tỷ lệ cá chết cao hơn ở 28°C. Trong nuôi cấy tế bào, SHRV có đường cong tăng trường tương tự nhau ở 20°C, 24°C, và 28°C, cho thấy sự tăng sinh của virus không bị ảnh hưởng ở nhiệt độ thấp. Ngược lại, độ tuổi và nhiệt độ không cho thấy có sự ảnh hưởng ở chủng đột biến (Rag1 mutant). Tỷ lệ chết cũng khác nhau giữa dòng hoang dại và đột biến. Dòng hoang dại bắt đầu chết từ ngày thứ 3 sau khi gây nhiễm và kéo dài đến ngày thứ 10, trong khi dòng đột biến tiếp tục chết trong vòng một tuần tiếp sau đó. Sự khác nhau trong đáp ứng miễn dịch của tế bào natural killer (NK) và tế bào T ở chủng đột biến và hoang dại được đánh giá thông qua mức biểu hiện của interferon gamma (IFNγ) gene từ mẫu thận trước bằng kỹ thuật quantitative reverse transcriptase PCR (qRT PCR). Gene biểu hiện mức thấp ở lô đối chứng âm nhưng tăng mạnh ở cả hai dòng khi được cảm nhiễm với SHRV. IFNγ tăng 400 lần và 100 lần ở Rag1 mutant tại nhiệt độ 24°C và 28°C; tăng 40 lần và 80 lần ở dòng hoang dại tại nhiệt độ 24°C và 28°C. Sự gia tăng mạnh mẽ của IFNγ trong dòng đột biến khuyết lymphocyte chứng tỏ có sự hoạt động của tế bào NK. Sự biểu hiện của MxA (Myxovirus Resistance gene A) gene cũng gia tăng ở cả nhóm không gây nhiễm (ngày thứ 8) và nhóm có gây nhiễm với virus (ngày thứ 2 và ngày thứ 8). Ngoài ra, sự biểu hiện của Blimp- 1 và CD40L gene cũng được đánh giá ở các ngày thứ 8, thứ 1 và thứ 7 sau khi công cường độc, tuy nhiên không có sự khác biệt. Kết quả cho thấy tầm quan trọng của miễn dịch sơ cấp trong việc kiểm soát sự xâm nhiễm của virus trong thời gian đầu, sau đó hệ miễn dịch thứ cấp tiêu diệt sự xâm nhiễm này. Hơn nữa, độ tuổi và nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến hệ miễn dịch thứ cấp. Các kết quả này có thể giúp cho việc giải thích nhiệt độ và lứa tuổi có liên quan đến sự kháng lại bệnh do novirhabdovirus trên cá. Từ khóa: Zebrafish, Rag1, T and B lymphocyte deficient, Snakehead Rhabdovirus, interferon gamma, MxA, Blimp-1, CD40 ligand. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ở cá mang xanh và cá nheo, tế bào T nhạy cảm Hệ miễn dịch của cá và sự đáp ứng miễn với nhiệt độ thấp trong khi tế bào B có khả dịch đã được biết ở cá trưởng thành. Nhiệt độ năng chịu được nhiệt độ (Cuchens & Clem, cũng gây ảnh hưởng đến hệ miễn dịch của cá. 1977), (Miller & Clem, 1984). Ở 10°C, tỷ lệ 1 Trung tâm Quan trắc Môi trường & Bệnh thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. 2 Mississippi State University. *Email: ngocduaqua@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 67 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II của các tế bào miễn dịch lớn như lymphocytes, sinh nằm trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho granulocytes, và macrophages gia tăng ở cá sự phát triển của zebrafish. Hơn nữa, chúng tôi chép, trong khi tế bào lymphocyte nhỏ bị giảm đánh giá sự biểu hiện của một số gene chọn lọc đi khi so sánh tỷ lệ các tế bào này của cá nuôi có liên quan đến sự đáp ứng miễn dịch nhằm ở 25°C(Kurata et al., 1995). Nhiệt độ cao xác định cách zebrafish trả lời lại sự xâm nhiễm làm gia tăng immunoglobulins và kháng thể của novirhabdovirus vào cơ thể. tự nhiên trong cá tuyết Atlantic, nhưng giảm II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP tổng protein huyết thanh và hoạt tính kháng protease (Magnadóttir et al., 1999). Ở cá vược 2.1. Chuẩn bị dịch gốc SHRV sọc, số lượng của leukocytes, lymphocytes, và SHRV có nguồn gốc từ ATCC được nuôi monocytes thấp hơn khi nuôi cá ở 10ºC so với trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified cá nuôi ở 18ºC, 24ºC, và 29ºC (Hrubec, 1997). Eagle’s Medium, Sigma- Aldrich Co., MO) bổ Gần đây, cá zebrafish được sử dụng như một sung thêm 10% FCS (Fetal calf serum, Biowest, mô hình quan trọng cho nghiên cứu về đáp ứng Nuaille, France), 100 đơn vị Penicillin/ 100 miễn dịch (Yoder et al., 2002) và thể hiện là một µg of Streptomycin (Gibco, Thermo Fisher mô hình tin cậy trong nghiên cứu miễn dịch ở Scientific Inc, MA), 4mM Glutamine (Gibco, động vật có xương (Trede et al., 2004). Rag1-/- Thermo Fisher Scientific Inc, MA), nuôi cấy mutant zebrafish là dòng cá đột biến bị khuyết ở 28°C cho đến khi quan sát được 80% hiện lymphocytes. Ở dòng đột biến, thành phần của tượng bệnh lý tế bào (CPE). Thu hoạch tế bào lymphocytes gồm có các tế bào không gây độc có chứa virus và ly tâm ở 200 xg trong 5 phút. (non-cytotoxic cells) và tế bào NK (natural Dịch nổi có chứa virus được chia đều vào các killer cells), nhưng không có những tế ...