Khảo sát đột biến CALR trên bệnh nhân xơ tủy nguyên phát bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Bài viết tiến hành nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA exon 9 của gen CALR để khảo sát đột biến, góp thêm 1 dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy nguyên phát trên lâm sàng.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Khảo sát đột biến CALR trên bệnh nhân xơ tủy nguyên phát bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017 KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN CALR TRÊN BỆNH NHÂN XƠ TỦY NGUYÊN PHÁT BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA Phan Thị Xinh*, Hoàng Anh Vũ** TÓMTẮT Mục tiêu: Xơ tủy nguyên phát là một dạng bệnh lý thuộc nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy có tủy xương bị xơ hóa, tăng sinh reticulin và gan lách tạo máu thay tủy. Các đột biến đặc trưng cho thể bệnh này bao gồm JAK2V617F (60%) và MPLW515L/K (5%). Gần đây, đột biến CALR được phát hiện trong khoảng 20 – 30% trường hợp xơ tủy nguyên phát với 2 loại đột biến phổ biến là mất 52 bp (loại 1), chèn 5 bp (loại 2) tại exon 9 gây lệch khung đọc và một số kiểu đột biến hiếm gặp khác. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA exon 9 của gen CALR để khảo sát đột biến, góp thêm 1 dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy nguyên phát trên lâm sàng. Đối tượng và phương pháp: Mẫu máu ngoại vi trong ống chống đông EDTA của bệnh nhân xơ tủy nguyên phát âm tính với đột biến JAK2V617F được tách chiết DNA. Các cặp mồi xuôi và mồi ngược được thiết kế để khuếch đại đặc hiệu exon 9 của gen CALR. Sản phẩm PCR được giải trình tự theo hai chiều xuôi và ngược trên hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer để khảo sát đột biến. Kết quả: Cặp mồi CALR-g8F và CALR-g9R dùng để khuếch đại vùng exon 9 của gen CALR có nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 550C. Phân tích kết quả giải trình tự chuỗi DNA ghi nhận 7/9 trường hợp có đột biến CALR chiếm 77,78%, trong đó phát hiện 2 kiểu đột biến bao gồm mất đoạn 52 bp (c.1099_1150del) và đột biến chèn thêm 5 bp (c.1154_1155insTTGTC), và các đột biến này đều ở dạng dị hợp tử. Kiểu mất đoạn 52 bp gặp ở 6 bệnh nhân, là kiểu đột biến thường gặp nhất trong nghiên cứu này. Kết luận: Chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA phát hiện các đột biến CALR exon 9, giúp dễ dàng chẩn đoán các trường hợp xơ tủy nguyên phát không có đột biến JAK2V617F và MPLW515L/K trên lâm sàng. Từ khóa: Xơ tủy nguyên phát, gen CALR, đột biến gen, giải trình tự chuỗi DNA ABSTRACT DETECTION OF CALR MUTATIONS IN PRIMARY MYELOFIBROSIS BY DNA SEQUENCING Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 21 - No 2 - 2017: 322 - 326 Purpose: Primary myelofibrosis (PMF) is a type of myeloproliferative neoplasms (MPNs) characterized by fibrosis in bone marrow, increased proliferation of reticulin and replacing bone marrow by liver and spleen for hematopoiesis. The typical mutations in this disease consist of JAK2V617F (60%) and MPLW515L/K (5%). Recently, CALR mutations were detected in approximately 20 – 30% of PMF patients with 2 common types of mutations including 52 bp deletetion (type 1) and 5 bp insertion (type 2) in exon 9 leading to the frameshift and several other rare mutations. We aim to establish a procedure of DNA sequencing for CALR exon 9 and use for screening CALR mutations as an additional marker for diagnosis of PMF patients in clinical practice. * Bộ môn Huyết học - Đại học Y Dược TP.HCM; khoa Di truyền học phân tử, Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM ** Bộ môn Mô phôi; Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM. Tác giả liên lạc: TS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932 728 115 Email: phanthixinh@yahoo.com 322 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017 Nghiên cứu Y học Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral blood samples of JAK2V617F- negative PMF patients. Forward and reverse primers were designed to amplify specifically CALR exon 9. PCR products were sequenced bidirectionally using Sanger’s technique on an ABI 3130 Genetic Analyzer system. Result: The primers CALR-g8F and CALR-g9R were used to amplify exon 9 of CALR with optimal annealing temperature at 550C. The analysis of DNA sequencing results showed that 7 out of 9 patients (77.78%) carried CALR mutations, with 2 types of mutations including 52-bp deletion (c.1099_1150del) and 5-bp insertion (c.1154_1155insTTGTC), both were in heterozygous status. The 52-bp deletion type was the most common mutation, detected in 6 patients. Conclusion: We have successfully established the DNA sequencing procedure for detection of CALR exon 9 mutations, facilitating diagnosis of PMF in patients without JAK2V617F and MPLW515L/K mutations. Key words: Primary myelofibrosis, CALR gene, gene mutation, DNA sequencing. ĐẶTVẤNĐỀ protein với trọng lượng 46-kDa có 3 vùng cấu trúc và chức năng bao gồm một vùng đầu tận Nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy bao gồm ...