Kỹ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn DNA, RNA) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ thuật chuyển genKỸTHUẬTCHUYỂNGENWEDNESDAY, 12. MARCH 2008, 11:25BIẾNĐỔIGENKỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn DNA, RNA) vào tế bào vậtchủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại vàtái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các proteinđặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của các cơthế chuyển gen. Ngày nay việc ứng dụng các giống cây trồng và cật nuôi chuyển gen càng trởnên phổ biến. Người ta ước tính hiện nay trên thế giới có khoảng hơn mộtnửa đậu tương và khoảng một phần ba ngũ cốc được trồng từ những hạt giống có chuyển gen.Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp.1. Chuyển gen trực tiếp bao gồm các phương pháp sau:- Kỹ thuật siêu âm- Kỹ thuật điện xung- Kỹ thuật PEG- Kỹ thuật vi tiêm- Kỹ thuật bắn gen- Kỹ thuật chuyển gen bằng sốc nhiệt2. Chuyển gen gián tiếp- Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens- Chuyển gen nhờ virus và phageSau đây là chi tiết một số phương pháp:PEG Mediated Transformation ofArabidopsis thaliana (var. Columbia O and Landsberg) Cell Suspensions Protoplasts1. Use cells 3 day after sub cultivation2. Split the cells in 1 tube (10 ml), spin the cells at 400 g for 5 min.3. Wash once with wall digestion buffer without enzymes (10 ml).4. Re-suspend pellet in digestion solution (7 ml) and dispense into a Petri dish.5. Incubate at 26°C in the dark for 6 hours shaking at 50 rpm.6. Collect protoplasts in 1 tube by centrifugation at 100 g for 5 min.7. Wash once in wall digestion solution without enzymes (10 ml).8. Centrifuge 100 g for 5 min9. Remove supernatant and dissolve pellet in remaining solution, add slowly 10 ml W5 solution,mix gently and centrifuge 100 g for 5 min10. Resuspend pellets in 10 ml of W5 solution, take aliquot for counting, store 20 min in the darkat 4°C. For protoplasts use always cut tips.11. Centrifuge 100 g for 5 min, remove all of W5 solution, resuspend pellet in MMM solution to adensity of 1-2 x 106 pps/ml.12. Redistribute l), add very g/ g of plasmid DNA (about 1 l into tubes, add 30 samples of 250l PEG solution, mix gently and incubate 15-30 min. slowly 25013. Gradually add 10 ml of W5 solution; this needs to be done very slowly.14. Centrifuge 100 g 5 min, 4°C.15. Dissolve pellet in 1,6 ml of K3 solution.16. Incubate at 26°C in the dark for 20 hours.Reference:Negrutiu, I., Shillito,R.D., Potrykus, I., Biasini,G. and Sala,F. Hybrid genes in the analysis oftransformation conditions I. Setting up a simple method for direct gene transfer in plantprotoplasts. Plant Mol. Biol., 8, 363-373, 1987.Solutions:• Wall digestion solution:for 15 ml:1% Cellulase 0,150 g0,25% Macerozym 0,037 g8 mM CaCl2(8 mM CaCl2 • 2H2O) 0,013 g(0,018 g)0,4 M Mannitol 1,093 gpH = 5,5steril filtrate• Wall digestion solution without enzymes:for 40 ml:8 mM CaCl2 • 2H2O 0,048 g0,4 M Mannitol 2,910 gpH = 5,5steril filtrate• W5 solutionfor 1 liter:154 mM NaCl 8,900 g125 mM CaCl2(125 mM CaCl2 • 2H2O) 13,873 g(= 18,377 g)5 mM KCl 0,373 g5 mM Glucose 0,990 gpH = 5.8 - 6.0autoclave• MMM solution for 0.5 liter:15 mM MgCl2 • 6H2O = 1,524 g0.1% MES = 0,500 g0.5 M Mannitol = 46,042 gpH = 5,8autoclave• PEG solution for 100 ml:40% PEG 4000 = 40 g0.4M Mannitol = 7,285 g0.1 M Ca(NO3)2• 4H2O = 2,361 gpH = 8 – 9 with 1-2 drops KOH 1N (the pH needs 1-2 hours to stabilize)autoclavefrozen in 1 ml aliquots• K3 solutionfor 100 ml:10 ml macro stock+ 0,1 ml micro stock+ 0,1 ml vitamins stock+ 0,5 ml EDTA stock + 1 ml Ca-Phosphate stock+ 10 mg Myo-Inositol+ 25 mg D(+)-Xylose+ 13,7 g SucrosepH = 5,6filter sterile and frozen in 10 ml aliquotsfor 1 liter macro stock:1,5 g NaH2PO4 • H2O9,0 g CaCl2 • 2H2O25 g KNO32,5 g NH4NO31,34 g (NH4) 2SO42,5 g MgSO4 • 7H2Oadd H2O up 1 literautoclavefor 100 ml micro stock:75 mg KI300 mg H3BO31 g MnSO4 • 7H2O (0,6 g MnSO4 • H2O)200 mg ZnSO4 • 7H2O25 mg Na2MoO4 • 2H2O2,5 mg CuSO4 • 5H2O2,5 mg CoCl2 • 6H2Oadd H2O up 100 mlfiltrate sterile and freezefor 100 ml vitamins stock:100 mg Nicotinacid100 mg Pyridoxin • HCl1 g Thiamin • HCladd H2O up 100 mlfiltrate sterile and freezefor 1 liter EDTA stock:7,46 g EDTA solve in 300 ml H2O (gently warm to dissolve)5,56 g Fe(II)SO4 • 7H2O solve in 300 ml H2O (gently warm to dissolve)mix and add H2O up 1 literautoclave and keep in the darkfor 200 ml Ca-Phosphate stock:1,26 g CaHPO4 • 2H2O solve in H2Oadd H2O up 200 mlpH = 3 with 25% HClautoclave and keep in the darkDNA extraction : 96 well plate protocolPhenol / Chloroform / IAA protocolSolutions1. 5% CTAB / Phosphate buffer (120mM pH 8.0)a. make 10% CTAB in 0.7M NaCl (heat to dissolve)b. make 240mM phosphate biffer pH 8.0c. mix 50/50 of the above two solutionsd. autoclave2. Phenol pH ...