Lai ADN – Phần 2

Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng xạ: Phương pháp đánh dấu phóng xạ là phương pháp được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm lai ADN với các thành phần đánh dấu là 32P và 35S. Kết quả của phép lai giữa mẫu dò và ADN đích được phát hiện trên X-phim hoặc nhấp nháy lỏng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp đánh dấu phóng xạ là độ nhạy có thể đạt tới dưới mức picrogam ADN đích. Hạn chế của phương pháp này là không đạt được sự thích hợp cần thiết cho các thí...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Lai ADN – Phần 2 Lai ADN – Phần 2 + Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng xạ: Phương pháp đánh dấu phóng xạ là phương pháp được dùng phổ biến trongcác phòng thí nghiệm lai ADN với các thành phần đánh dấu là 32P và 35S. Kết quảcủa phép lai giữa mẫu dò và ADN đích được phát hiện trên X-phim hoặc nhấpnháy lỏng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp đánh dấu phóng xạ là độ nhạy có thểđạt tới dưới mức picrogam ADN đích. Hạn chế của phương pháp này là không đạtđược sự thích hợp cần thiết cho các thí nghiệm chẩn đoán li ên quan tới xác địnhmẫu vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy hiểm cho người sửdụng và cần yêu cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sửdụng cũng như việc quản lý chất thải. Xuất phát từ thực tế trên mà càng ngày người ta càng quan tâm đến cácphương pháp đánh dấu phi phóng xạ. Mục tiêu là đạt được một hệ thống đánh dấucó độ nhạy tương đương với phương pháp dùng chất phóng xạ. Bảng dưới đây liệtkê các yêu cầu lý tưởng cho phương pháp đánh dấu mẫu dò: 1, Dễ gắn với acid nucleic theo phương pháp đơn giản và có độ lặp lại cao. 2, Bền trong điều kiện lai và bảo quản. 3, Không bị ảnh hưởng và làm ảnh hưởng đến phản ứng lai. 4, Có thể thực hiện với điều kiện phản ứng lai trong dịch thể (liquid phase)hay có chất mang (solid phase). 5, Phương pháp phát hiện nhạy và đơn giản. 6, Dễ bị loại bỏ sau phản ứng lai. 7, Dễ phân biệt giữa mẫu lai và mẫu chưa lai trong cùng điều kiện. 8, Có thể ứng dụng với hệ thống tự động hoá. Tuy nhiên, nếu theo các yêu cầu lý tưởng trên thì chưa có hệ thống đánh dấuphi phóng xạ nào thoả mãn. Hiện nay, có nhiều hệ thống đánh dấu phi phóng xạ đạt độ nhạy cao và đó làlý do các phương pháp này đang được ứng dụng rộng rãi đặc biệt là phương phápdựa trên các enzym như Alkaline phosphatase, Horseradisk peroxidase. Tuy nhiênphương pháp sử dụng các chất phóng xạ hiện tại vẫn đang được dùng cho một sốphòng thí nghiệm đặc biệt. · Chiến lược đánh dấu với chất phi phóng xạ. Có 3 phương pháp đánh dấu phi phóng xạ: 1, Dùng cơ chất hoá phát xạ và sinh phát xạ, trong trường hợp này thì cả cơchất hoá và sinh phát quang đều tạo ra các bức xạ ánh sáng và sau đó là phươngpháp phát hiện bức xạ này. * Với nguồn cơ chất hoá phát quang có loại nh ư AMPPD (Bronstein,Edward & Voyta, 1989) có thể được dùng trực tiếp như là cơ chất cho enzymAlkaline phosphatase trong phép lai ADN đạt độ nhạy cao trong thời gian ngắn(Bronstein et al., 1990). * Phương pháp phát xạ sử dụng enzym Alkaline phosphatase trên cơ sở giảiphóng D-luciferin từ cơ chất, ví dụ D-luciferin-O-phosphate (Miska và Geiger.,1987). Hai phương pháp này tương đối nhạy và đang được sử dụng rộng rãi. 2, Phương pháp phát hiện dựa vào thay đổi màu: Phương pháp đo màu có thể thực hiện trên môi trường dịch thể hay chấtmang và khá nhạy so với phương pháp phát quang. Người ta đã tạo ra các cơ chấtsinh màu khi có mặt enzym (chẳng hạn như Alkaline phosphatase). Lợi thế củaphương pháp này là việc phát hiện đơn giản do kết quả là sự thay đổi màu dễ pháthiện và ứng dụng trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật. Một phương pháp có thể làm tăng độ nhạy của phản ứng màu bằng cáchthêm một enzym kích hoạt phản ứng màu vào hệ thống. Một ví dụ cho điều này làvai trò loại nhóm phosphat của phân tử NADP thành NAD do Alkalinephosphatase trong hệ thống phát hiện mẫu d ò nucleic. Trong hệ thống này thìNAD có vai trò kích hoạt chu trình oxy hoá mà có sự tham gia của alcoholdehydrogenease và diaphorase. Trong mỗi một chu trình thì NAD sẽ bị khử thànhNADPH + H+. Phản ứng oxy hoá này lại kèm theo phản ứng oxy hoá mà NADPH+ H+ lại bị oxy hoá thành NAD, mọi phản ứng xảy ra gắn liền với việc khử ρ-indonitro-tetrazolium màu tím thành formazan. Sản phẩm cuối cùng formazanđược định lượng bằng phép so màu (Self. 1985). 3, Cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời gian. Sử dụng cơ chất phát xạ huỳnh quang l à phương pháp khá nhạy và có thểphát hiện được tới một phân tử chất phát xạ (fluorescein). Nói chung với các mẫusinh phẩm thường có mức độ nhiễu tín hiệu nền cao. Thực tế n ày có thể được cảithiện với cơ chất fluorophore bền bị kích hoạt bởi sóng ánh sáng. Sự phát xạ sauđó được ghi lại khi các bức xạ nền đã bị giảm. Đối với phương pháp dùngAlkaline phosphatase thì việc phát hiện nhân tố gắn lanthanide theo thời gian đikèm với hoạt tính enzym này gọi là phương pháp phát quang lanthanide khuyếchđại bởi enzym (EALL: Evangelista, Pollack & Templeton, 1991). Trong tr ườnghợp này, cơ chất không có khả hình thành phức hệ gắn với lathanide phát xạ. Dướitác dụng của Alkaline phosphatase thì cơ chất và lanthalide bị chuyển thành phứchệ hoạt động. Phương pháp này khá nhạy nhưng hạn chế lớn nhất của nó là cầnthiết bị kích hoạt và đo bức xạ huỳnh qu ...