Lai ADN – Phần 4

Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN. Giới thiệu phương pháp: Như đã trình bày, sự phức tạp trong kỹ thuật RELP đã tạo ra những khó khăn cho việc xác định các tác nhân gây bệnh trong các nghiên cứu về dịch tễ học. Điều này còn khó khăn và phức tạp hơn trong khi so sánh các kết quả thu được trên các bản gel khác nhau hoặc tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Nguyên nhân là do số lượng các băng ADN lớn tới mức không thể xác định kích thước của chúng hay...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Lai ADN – Phần 4 Lai ADN – Phần 4+ Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN. Giới thiệu phương pháp: Như đã trình bày, sự phức tạp trong kỹ thuật RELP đã tạo ra những khó khăncho việc xác định các tác nhân gây bệnh trong các nghiên cứu về dịch tễ học. Điềunày còn khó khăn và phức tạp hơn trong khi so sánh các kết quả thu được trên cácbản gel khác nhau hoặc tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Nguyên nhân là do sốlượng các băng ADN lớn tới mức không thể xác định kích thước của chúng haycác băng thu được không lặp lại các kết quả nghiên cứu. Mặc dù vậy, theo phương pháp này các phổ ADN phức tạp sau khi xử lý vớienzym cắt hạn chế sẽ được làm biến tính và chuyển lên màng nitroxenluloza haynylon. Màng sẽ được lai với mẫu dò thích hợp, kết quả phổ phép lai sẽ rõ vàkhông quá phức tạp do nó chỉ hiển thị các mảnh ADN bắt cặp với mẫu dò. Vớimột số lượng không lớn các mảnh hiển thị thu được sau phép lai sẽ cho phép xácđịnh được chính xác hơn về kích thước. Điều này làm cơ sở cho so sánh giữa cácgel với nhau cũng như kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau. Khi sử dụng phương pháp này cần chú ý một số mẫu dò sau: 1, Mẫu dò có thể là đoạn RNA ribosom từ một loài sinh vật nào đó: ví dụrRNA của E.coli có thể được các công ty thương phẩm cung cấp (BoeringerMannheim), đây là mẫu dò khá thuận lợi và được đánh dấu phóng xạ hay với cáccơ chất huỳnh quang. Ưu điểm chính của mẫu dò này ở chỗ phần RNA là đoạnkhá bảo thủ do đó mẫu dò có thể dùng lai với các sản phẩm xử lý enzym cắt hạnchế của nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Có một số loài khi lai với mẫu dò chỉ chomột kết quả giống nhau trong khi đó ở loài khác khi lai các chủng với mẫu dò thìlại thu được kết quả khác nhau. Đây là cơ sở cho phương pháp ribotyping. 2, Mẫu dò có thể là đoạn ADN ngẫu nhiên có chức năng không xác định(Tompkins et al., 1986). Mẫu dò này thường được dùng cho các loài có chứa chínhcác đoạn ADN này. Sử dụng các mẫu dò này đôi khi rất có ý nghĩa trong việc phânbiệt các mẫu sau khi tiến hành phương pháp ribotyping (Saunders et al., 1990). 3. Một cách khác nữa cũng được dùng là sử dụng mẫu dò là một đoạn ADNtách dòng từ một gene đã biết. Ví dụ dùng đoạn gene mã hoá cho độc tố ngoại bào(exotoxinA) sử dụng để định typ Pseudomonas aeruginosa (Ogle et al., 1987).Mẫu dò dùng gene mã hoá cho độc tố Cholera được dùng để xác định các typ chocác chủng thuộc họ phảy khuẩn sinh độc tố (Yam, Li Lung & Ng, 1989). Việc sửdụng bất kỳ loại mẫu dò nào cũng tạo ra phổ đặc trưng của phép lai có ý nghĩa choso sánh giữa các chủng với nhau. Hạn chế chính của kỹ thuật này ở chỗ kết quả thu nhận chỉ khu trú phần genebắt cặp với mẫu dò mà không đặc trưng cho cả hệ gene.Bảng 1.6. Kết quả thu đ ược khi thực hiện kỹ thuật RFLP với dùng các mẫu dòkhông phải là ribosom. Đối tượng Tác giả nghiên cứu và tài liệu dẫn Aeromonas spp Altwegg an Luthyhottenstein (1991) Borrelia burgorferi Wallich et al (1992) Candida albicans Schmid et al (1992) Chlamydia trachomatis Scieux et al (1992) Corynebacterium diphtheriae Groman et al (1993) Cryptococcus noeformans Spitzer (1992) Escherichia coli Bohm ADN Karch (1992) Hemophilus influenzae Forbes et al (1992) Histoplasma capsulatum Leathet al (1992) Lactobacillus helveticus Delostreyesgavilan et al (1992) Mycobacterium tuberculosis Mazurek et al (1991) Pseudomonas aeruginosa Tompkins(1991) Salmonella spp Sodati ADN Piffaretti (1991) Staphylococcus aureus Goh et al (1992)- Kỹ thuật ribotyping: Như đã trình bày ở trên mọi mẫu dò đều cho các kết quả có sức thuyết phụctuy nhiên kỹ thuật dùng mẫu dò là đoạn RNA của ribosom đã đưa ra một cách tiếpcận mới trong nghiên cứu dịch tễ phân tử với các vi khuẩn có sự khác biệt lớntrong khi đó các mẫu dò khác chỉ giới hạn với một loài hay chỉ có ý nghĩa cho cácchủng trong cùng một loài. Kỹ thuật này lần đầu tiên được Grimont mô tả năm1986 và nhanh chóng trở thành phương pháp hữu hiệu hiện nay cho nghiên cứudịch tễ học vi sinh vật ở mức độ phân tử. Tính hợp lý cho việc sử dụng kỹ thuật này là ở chỗ gene mã hoá cho RNAribosom có độ bảo thủ cao. Cũng có thể phát hiện thấy những thay đổi chút íttrong quá trình tiến hoá đối với các chuỗi ADN trong các vi khuẩn nghiên cứu.Gene RNA ribosom được tổ chức thành các operon mà các gene riêng rẽ mã chocác RNA kích thước 5S, 16S và 23S chúng được cách nhau bằng các đoạn ADNspacer không mã cho gene nào. Nếu dùng mẫu dò hỗn hợp giữa 16S và 23S thì kếtquả phép lai sẽ hiển thị các mảnh tương ứng với phần c ...