Lựa chọn phương pháp xử lý mảnh mô niêm mạc miệng để nuôi tạo tấm biểu mô trên thỏ thực nghiệm

Mục tiêu của nghiên cứu này là tìm ra vị trí trích thủ mảnh niêm mạc miệng dùng làm mẫu mô nuôi cấy. Kích thước cần thiết của mẫu mô để nuôi tạo 2 tấm biểu mô niêm mạc miệng. Phương pháp xử lý mẫu mô niêm mạc miệng tối ưu cho nuôi cấy và phù hợp với điều kiện của Việt Nam.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Lựa chọn phương pháp xử lý mảnh mô niêm mạc miệng để nuôi tạo tấm biểu mô trên thỏ thực nghiệmTẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013LỰA CHỌN PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ MẢNH MÔ NIÊM MẠC MIỆNG ĐỂ NUÔI TẠOTẤM BIỂU MÔ TRÊN THỎ THỰC NGHIỆMĐỗ Thùy Hương*; Nguyễn Thị Bình* và CSTÓM TẮTSử dụng kỹ thuật hiển vi quang học, hiển vi điện tử để theo dõi, đánh giá hiệu quả nuôi cấy cácmảnh mô niêm mạc miệng theo 3 cách: mảnh mô nguyên, mảnh mô bóc và dịch treo. Kết quả: Niêmmạc má là vị trí thích hợp để lấy mẫu mô nuôi cấy. Kỹ thuật xử lý tạo mảnh mô bóc đơn giản, phùhợp sinh lý, có hiệu quả nuôi cấy tốt, tương đương với phương pháp xử lý tạo dịch treo và tốt hơnso với cách xử lý để nguyên mảnh mô. Kỹ thuật xử lý tạo mảnh mô bóc là lựa chọn tối ưu để nuôicấy tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng.* Từ khoá: Nuôi cấy tế bào; Tấm biểu mô niêm mạc miệng; Mảnh mô bóc.OPTIMAL METHOD FOR TREATMENT OF ORAL MUCOSAL TISSUE USED TOCREATE CULTURAL EPITHELIAL SHEETSummaryThree different treatment methods were applied: explants, epithelium alone and suspension. Themorphological characteristics and ultrastructural features of cultivated epithelial cells from eachmethod were assessed by light microscope, scanning microscope and transmission microscope.Results: buccal mucosal with suitable characteristics is considered the best candidate for culturingso as to create epithelial sheet. The epithelial alone method is not only easier, less time-consumingthan other methods but also it proposes a good cultural condition quite near in vivo. No significantdifference in quality of epithelial sheets formed by epithelial alone method and the one formed bysuspension method was found. Conclusions: buccal mucosal and epithelial alone method are theoptimal technique used to culture oral mucosal epithelial stem cell.* Key words: Cell culture; Oral mucosal epithelial cell sheet; Epithilium alone.ĐẶT VẤN ĐỀHội chứng suy giảm tế bào gốc (TBG) vùngrìa (SGTBGVR) là hậu quả của nhiều nguyênnhân như: bỏng, nhiễm khuẩn, hội chứngStevens-Johnson..., làm mất khả năng tái tạobiểu mô giác mạc. Ghép tấm biểu mô giácmạc nuôi cấy tự thân đã được áp dụngthành công trên BN bị hội chứng SGTBGVRở một bên mắt [2]. Với những BN bị tổnthương cả hai mắt, nhiều nghiên cứu đãdùng các loại biểu mô tự thân thay thế khácnhư: biểu mô kết mạc, biểu mô niêm mạcmiệng, biểu mô niêm mạc mũi [3].* Trường Đại học Y Hà NộiNgười phản hồi (Corresponding): Đỗ Thùy Hương (dohuongus@yahoo.com)Ngày nhận bài: 20/5/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 12/6/2013Ngày bài báo được đăng: 20/6/201345TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013Khi nuôi cấy TBG biểu mô niêm mạc miệng,khâu lựa chọn và xử lý mảnh mô ban đầucó vai trò quan trọng quyết định chất lượngvà tốc độ phát triển của tấm biểu mô. Hiệnnay, có hai cách xử lý mảnh mô là tạo dịchtreo tế bào biểu mô hoặc đặt trực tiếp mảnhmô niêm mạc miệng lên trên giá thể nuôicấy. Trong điều kiện Việt Nam, để có đượclớp tế bào nuôi 3T3 sử dụng phương phápnuôi bằng dịch treo gặp rất nhiều khó khăn.Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiêncứu nuôi cấy, trong đó sử dụng hai phươngpháp xử lý mẫu nói trên và một phươngpháp xử lý mới khác chưa được đề cập tớitrong y văn thế giới, tạm gọi là: kỹ thuật xửlý tạo mảnh mô bóc.Mục tiêu của nghiên cứu này là tìm ra:- Vị trí trích thủ mảnh niêm mạc miệngdùng làm mẫu mô nuôi cấy.- Kích thước cần thiết của mẫu mô đểnuôi tạo 2 tấm biểu mô niêm mạc miệng.- Phương pháp xử lý mẫu mô niêm mạcmiệng tối ưu cho nuôi cấy và phù hợp vớiđiều kiện của Việt Nam.ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Đối tượng nghiên cứu.- Mảnh niêm mạc miệng thỏ chủngOritolagus cuniculus.- Màng ối người đã được xử lý theo quytrình chuẩn của Bộ môn Mô - Phôi, TrườngĐại học Y Hà Nội.- Môi trường nuôi cấy: DMEM/F12 có bổsung các yếu tố insulin, EGF, triiodothyronine,isoproterenol, hydrocortisone, FBS…2. Phương pháp nghiên cứu.- Trích thủ mảnh niêm mạc miệng thỏ(kích thước 8 x 8 mm) ở các vị trí khácnhau trong khoang miệng: vùng môi, vùngmá, vùng dưới lưỡi, làm tiêu bản đánh giácấu trúc vi thể.- Tiến hành xử lý mảnh mô theo 3 phươngpháp (mảnh mô nguyên vẹn, tạo dịch treotế bào, tạo mảnh mô bóc).+ Làm sạch và cắt lọc mảnh mô:. Rửa mảnh mô 2 lần bằng dung dịch PBStrong vòng 10 phút.. Cắt lọc phần mô đệm bên dưới biểu mô.. Cắt mảnh mô thành các miếng nhỏ 1 x1 mm.+ Kỹ thuật xử lý để nuôi bằng mảnh mônguyên vẹn:. Ủ miếng mô trong dung dịch Dispase IIở 370C trong 10 phút, sau đó chuyển mảnhmô sang dung dịch EDTA 0,2% trong 3 5 phút.. Rửa miếng mô 3 lần trong môi trườngnuôi cấy.. Nuôi mảnh mô trên nền màng ối trongmôi trường nuôi cấy ở điều kiện 370C, 5%CO2.+ Kỹ thuật xử lý tạo dịch treo tế bào:. Ủ miếng mô trong dung dịch Dispase IIở 370C trong 45 phút. Bóc tách lớp biểu mô ra khỏi mô nền.. Ủ lớp biểu mô với trypsin-EDTA trong10 phút.. Đánh tan lớp biểu mô để tạo dịch treotế bào.. Gieo vào giếng nuôi cấy với mật độ2 - 2,5 x 105 tế bào/giếng.. Nuôi trên nền màng ối trong môi trườngnuôi cấy ở điều kiện 370C 5%CO2, có lớp tếbào nuôi 3T3.+ Kỹ thuật xử lý tạo mảnh mô bóc:. Tiến hành các bước giống với kỹ thuậtnuôi dịch treo cho đến khi bóc tách lớp biểumô ra khỏi mô nền (các mảnh mô được cắt47TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013thành miếng 0,5 x 0,5 mm), sau đó ủ lớpbiểu mô với Trypsin-EDTA trong khoảng 1 2 phút.. Rửa mảnh biểu mô 3 lần bằng môitrường nuôi cấy.. Nuôi trên nền màng ối trong môi trườngnuôi cấy ở điều kiện 370C 5% CO2 có lớp tếbào nuôi tạo bởi các nguyên bào sợi tự thân.+ Theo dõi sự phát triển của TBG bằngkính hiển vi soi nổi và soi ngược.2. Chỉ tiêu nghiên cứu.- Đánh giá cấu trúc vi thể của niêm mạcmiệng thỏ ở các vùng khác nhau.- Đánh giá hiệu quả nuôi cấy TBG biểumô niêm mạc miệng khi sử dụng mảnh môxử lý theo 3 cách: để nguyên mảnh mô, tạodịch treo tế bào và tạo mảnh mô bóc thôngqua tỷ lệ nuôi cấy thành công và chất lượngcủa tấm biểu mô.- Nghiên cứu ...