Luận văn : Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường part 3

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Thời gian tiến hành từ ngày 14/04/2005 đến ngày 15/09/2005 3.1.2. Địa điểm Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Chăn nuôi Thú y và Trung tâm phân tích Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn có khả năng tạo acid lactic 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu - Chế phẩm Biolactyl của Pháp ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn : Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường part 3 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Thời gian tiến hành từ ngày 14/04/2005 đến ngày 15/09/2005 3.1.2. Địa điểm Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Chăn nuôi Thú yvà Trung tâm phân tích Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn có khả năng tạo acid lactic 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu - Chế phẩm Biolactyl của Pháp - Chế phẩm Antibio của Hàn Quốc - Đại mạch của trường Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm Tp. HCM 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm - Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, cân điện tử, máy đo pH,máy li tâm, máy đo OD, nồi hấp áp suất, tủ lạnh, máy cất nước và bếp điện. - Dụng cụ: ống eppendorf, erlen, cốc, bình định mức, ống đong, đĩa petri, ốngnghiệm, buret, phễu chiết, pipet và pipetman. 3.2.4. Môi trường nuôi cấy - Môi trường MRS broth (de Man, Rogosa and Sharpe broth) [36] - Môi trường MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar) - Môi trường YGC agar (Yeast extract Glucose Calcium carbonat) [37] - Môi trường thử khả năng lên men đường [11] - Môi trường thạch nitrate bán lỏng - Môi trường thử khả năng phân giải gelatin - Môi trường thạch bán lỏng di động - Môi trường thử khả năng sinh indol Thành phần và tỉ lệ môi trường nuôi cấy được trình bày ở mục 1 phần phụ lục. 22 3.2.5.Thuốc nhuộm và thuốc thử - Dung dịch thuốc nhuộm Bromocresol Purple 0,2% [11] - Thuốc nhuộm Gram [11] - Thuốc thử uphenmen [11] - Thuốc thử DNS [10] - Thuốc thử và hóa chất dùng chuẩn độ Thành phần và tỉ lệ của thuốc nhuộm và thuốc thử được trình bày ở mục 2 phần phụ lục.3.3. Phương pháp thí nghiệm 3.3.1. Phân lập và sơ chọn giống 3.3.1.1. Quan sát đại thể - Môi trường MRS agar và YGC agar + Nguyên tắc: dựa vào đặc tính sinh acid của các khuẩn lạc. Giống phân lập trên môitrường YGC agar, CaCO3 sẽ bị tan khi tác dụng với acid tạo nên vòng trong suốt quanhkhuẩn lạc. + Thực hiện * Pha loãng mẫu trong nước cất vô trùng với các độ pha loãng khác nhau. * Trãi đều 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng lên môi trường MRS agar. Nuôicấy ở nhiệt độ 37o C và theo dõi sự phát triển khuẩn lạc sau 48 giờ. * Chọn những khuẩn lạc mọc riêng lẻ, cấy ria trên môi trường YGC agar. Nuôi cấyở nhiệt độ 37o C. Sau 48 giờ, chọn các khuẩn lạc sinh acid nhờ vào vòng trong suốt xuấthiện quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lượng acid sinh ra càng nhiều. - Môi trường MRS broth Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể. Nuôi cấytĩnh ở nhiệt độ 37o C. Ghi nhận các đặc điểm sinh trưởng trong 24 giờ. 3.3.1.2. Quan sát vi thể Hình thái: Nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào ở vật kính x100 [5] (Xem ởmục 3.2 phần phụ lục). 3.3.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic [6], [11], [31] - Thực hiện + Cấy vi khuẩn đã phân lập được vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRSdịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37o C trong 24 giờ. + Li tâm thu dịch trong. 23 + Lấy 5 ml dịch cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. Quan sát sự đổi màu. Tiến hành đồng thời 2 ống đối chứng: + Ống 1: 5 ml môi trường MRS (không nuôi vi khuẩn) thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. + Ống 2: 5 ml acid lactic tinh khiết, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. 3.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng [11] - Nguyên tắc: Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng được bằngdung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử phenolphtalein. - Thực hiện: ( xem ở mục 3.1 phần phụ lục) 3.3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa 3.3.4.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng - Ảnh hưởng pH Điều chỉnh pH môi trường bằng CH3COOH và NaOH sao cho pH ban đầu là : 4,5, 6, 7 (pH sau khi khử trùng ). Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trường (gồm có 10% mật rỉ và 0,5 % cao nấm men). Nuôi cấy ở 37o C. Sau 24 giờ, xác định lượng acidtổng tích lũy được trong dịch nuôi cấy tương ứng với các độ pH khác nhau. Chọn pHthích hợp cho sự tích lũy acid của các khuẩn lạc. - Ảnh hưởng nhiệt độ Sau khi chọn được pH thích hợp cho các khuẩn lạc, khảo sát ở nhiệt độ phòng, 37o C,45o C, 50o C. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trường (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % nấmmen). Sau 24 giờ, xác định lượng acid tổng tích lũy được trong dich nuôi cấy tương ứng. - Ảnh hưởng tỉ lệ mật rỉ Chọn được pH, nhiệt độ thích hợp cho các khuẩn lạc. Khảo sát tỉ lệ mật rỉ: 5 %, ...