Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình định lượng Cytomegalovirus (CMV) trong máu, nước tiểu bằng phương pháp Real Time PCR

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình định lượng Cytomegalovirus (CMV) trong máu, nước tiểu bằng phương pháp Real Time PCR thực hiện thiết kế primers, TaqMan probe đặc hiệu định lượng CMV; khảo sát các điều kiện phản ứng nhằm tối ưu hóa phản ứng Real-Time PCR và xây dựng quy trình định lượng CMV trong máu và trong nước tiểu; ứng dụng quy trình chẩn đoán trên một số bệnh phẩm.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình định lượng Cytomegalovirus (CMV) trong máu, nước tiểu bằng phương pháp Real Time PCR BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------------------- Đặng Hồng Cúc XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CYTOMEGALOVIRUS (CMV) TRONG MÁU, NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. CAO MINH NGA Thành phố Hồ Chí Minh - 2010 Lời cảm ơn Với lòng kính trọng và chân thành, tôi xin cảm ơn: Quý thầy, cô Khoa Sinh Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt khóa học. Cô TS Trần Thanh Thủy, trưởng bộ môn Vi sinh vật, khoa Sinh, trường Đại học Sư Phạm TP HỒ CHÍ MINH đã luôn tạo mọi thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cô PGS. TS Cao Minh Nga, giảng viên chính bộ môn Vi sinh, khoa Y, trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, phó trưởng khoa xét nghiệm bệnh viện Đại học Y Dược đã tận tâm hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn. Cử nhân Hồ Thị Thanh Thủy- PGĐ công ty cổ phần công nghệ Việt Á, cử nhân Nguyễn Văn Hưng- trưởng phòng dịch vụ & KCS, cùng tập thể cán bộ, công nhân viên các phòng của công ty đã tận tình giúp đỡ tôi về thực nghiệm của đề tài để tôi hoàn thành kết quả luận văn này. ThS- BS Phùng Như Toàn- Trưởng phòng tham vấn tiền sản, Th.S Bs Lê Minh Hoài An- Trưởng khoa Xét nghiệm, Bs Lê Nguyễn Bảo Trân-trưởng P.A8- phòng xét nghiệm dịch vụ, KTV Tôn Nữ Thu Trang cùng tập thể nhân viên phòng xét nghiệm bệnh viện Từ Dũ đã tạo mọi thuận lợi và cung cấp cho tôi số liệu và mẫu bệnh phẩm (nước tiểu, máu) nhiễm CMV . Dược sĩ Nguyễn Thanh Tòng- Trưởng khoa Xét nghiệm Trung tâm y khoa Medic, BS Nguyễn Bảo Toàn-phòng Sinh học phân tử và KTV Đặng Đình Triển, phòng xét nghiệm kháng thể trung tâm y khoa Medic đã cung cấp cho tôi số liệu và mẫu bệnh phẩm nhiễm CMV, HSV. Tập thể các bạn lớp cao học K18 – khoa Sinh, trường Đại học Sư Phạm TP HCM đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt khóa học và làm luận văn. Xin chân thành cảm ơn. Đặng Hồng Cúc DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT - BLAST: Basic local alignment tool - CMV: Cytomegalovirus - COBAS: COBAS AMPLICOR™ CMV MONITOR - CSF: Cerebrospinal fluid: dịch não tủy. - Da: Dalton, đơn vị đo khối lượng phân tử protein. - DNA: Deoxyribonucleic acid - dNTP: Deoxynucleoside triphosphate - dNTP: deoxynucleotie triphosphate - dUTP: deoxy Uracil triphosphate. - EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid. - gB: glycoproteinB - GE: genome-equivalent - IDT: Intergrated DNA Technologies - IE: immediate early: sớm tức thì - LC-PCR: LightCycler® polymerase chain reaction - PBL: Peripheral blood leucocytes: bạch cầu máu ngoại biên - PMNLs: polymorphonuclear leucocytes: bạch cầu đa nhân - Pol: polymerase. - PTLD: post-transplant lymphoproliferative disorder: rối loạn tăng sinh tế bào lympho sau ghép. - qPCR: quantitative polymerase chain reaction: PCR định lượng - UL: unique long - UNG: Uracyl – N – glycosylase - WB: whole blood: máu toàn phần. MỞ ĐẦU Nhiễm Cytomegalovirus (CMV) là loại nhiễm virus thường gặp trong cộng đồng, chiếm tỉ lệ từ 60% đến 99% người lớn trên toàn thế giới [51], nhưng hiếm khi gây ra triệu chứng lâm sàng, vì vậy chẩn đoán nhiễm CMV ít khi được quan tâm. CMV là tác nhân sinh bệnh nhiễm trùng cơ hội và nguy cơ bệnh CMV tùy thuộc sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Nhiễm CMV sẽ tái kích hoạt khi bệnh nhân có hệ thống miễn dịch suy yếu, và là tác nhân gây bệnh nặng, thậm chí gây tử vong cho những người sử dụng thuốc ức chế miễn dịch, cũng như những người cấy ghép nội tạng, và đặc biệt những người nhiễm virus HIV. CMV còn là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bẩm sinh thường gặp ở thai phụ- nhiễm trùng ToRCH (Toxoplasmase, Rubella, CMV, Herpes simplex virus), gây nguy hại cho thai nhi: 0,5%-2,5% trẻ sơ sinh mắc bệnh CMV bị vàng da, lách to, giảm tiểu cầu, suy thai, nhỏ đầu, viêm võng mạc, CMV có thể để lại di chứng khốc liệt lúc mới sinh[11], [12], [13], [24], [72]. Ngoài ra, một nghiên cứu mới tại Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC) xuất bản trong số ra ngày 15 tháng 5 năm 2009, cho thấy lần đầu tiên CMV, là một nguyên nhân gây ra huyết áp cao, khi kết hợp với yếu tố nguy cơ khác đối với bệnh tim, CMV có thể gây ra xơ vữa, hoặc xơ cứng động mạch [51]. Do đó, chẩn đoán sớm nhiễm CMV để đánh giá chính xác tình trạng của bệnh nhân là rất cần thiết. Đã có nhiều công trình nghiên cứu chẩn đoán nhiễm CMV như tìm kháng thể IgG-CMV, IgM-CMV, nuôi cấy virus, tìm tế bào nội mô....đều cho kết quả khả quan. Đặc biệt, cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, người ta cũng đã sử dụng PCR định tính CMV nhưng phương pháp này khó phân biệt nhiễm tiềm tàng (nhiễm CMV không biểu hiện triệu chứng) hay nhiễm họat động (nhiễm CMV biểu hiện triệu chứng). Jiska Jebbink, và cộng sự [42] đã chỉ ra rằng nếu số lượng CMV khoảng 10.000 genomes virus /ml mẫu máu là báo trước nhiễm CMV có nguy cơ cao phát triển thành bệnh CMV. Ngoài ra còn một số công trình khác cũng chỉ ra mối tương quan giữa số lượng virus trong mẫu thử và bệnh CMV (bảng 1). Bảng 1: Minh họa các kết quả định lượng CMV tương quan bệnh CMV Không Số lượng Biểu Tài liệu biểu ...