Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của Virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật Real Time PCR

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của Virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật Real Time PCR xây dựng quy trình xác định các đột biến kháng thuốc Adefovir của HBV tại rtA181V/T và rtN236T bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan probe, chi phí thấp để phát triển thành kit phục vụ quá trình điều trị viêm gan siêu vi B trong tương lai.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của Virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật Real Time PCR THƯ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ‫ ٭٭٭٭‬   ‫٭٭٭٭‬ LÊ THỊ DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN rtA181V/T VÀ rtN236T KHÁNG ADEFOVIR CỦA VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B Virus) BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 60 40 60 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. CAO MINH NGA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài: Viêm gan (VG) còn gọi là sưng gan, là một tình trạng bệnh lý phổ biến do thương tổn ở tế bào gan. Có nhiều nguyên nhân gây ra VG như: vi khuẩn, rượu, hóa chất và một vài loại thuốc cũng như vô số loại virus, trong đó có virus viêm gan B (VRVGB) [20]. VRVGB hay Hepatitis B virus (HBV) là một trong những virus tiêu biểu của họ Hepadnaviridae, một họ gây VG cho nhiều loài động vật. HBV lây truyền qua đường máu, đường tình dục, từ mẹ sang con, qua tiếp xúc,… Quá trình nhiễm bệnh của HBV kéo dài, diễn tiến nặng, tỷ lệ tử vong cao. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) có hơn 2 tỷ người trên thế giới nhiễm HBV trong thời điểm nào đó của cuộc đời, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan [6]. Đến năm 2004, số người nhiễm HBV trên toàn cầu đã tăng lên 400 triệu người [28]. Vì vậy, nhiễm VRVGB mạn tính được xem như một vấn đề y tế mang tính chất toàn cầu. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng nội dịch của bệnh với tỷ lệ nhiễm VRVGB mạn tính vào khoảng 15-20% dân số, nghĩa là có trên 10 triệu trong tổng số khoảng 80 triệu người bị nhiễm VRVGB [8]. Các thuốc đặc hiệu dùng để điều trị cho người mang HBV mạn tính gồm hai loại là thuốc uống và thuốc tiêm. Thuốc tiêm gồm Interferon alfa-2b và PEG Interferon alfa-2a, đây là loại thuốc vừa ức chế siêu vi vừa tăng cường miễn dịch nhưng đắt tiền và nhiều tác dụng phụ. Còn thuốc uống gồm Lamivudine (LAM), Adefovir dipivoxil (ADV), Entecavir (ETV) và Tenofovir (TDF)... được Cơ quan Quản lý Thực – Dược Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận cho sử dụng. Ở Việt Nam hiện nay, ADV và LAM được sử dụng chủ yếu trong điều trị cho bệnh nhân viêm gan B mãn tính. ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song vẫn hiệu quả với siêu vi đã kháng LAM. Do vậy, trong điều trị người ta thường kết hợp ADV khi bắt đầu có hiện tượng virus kháng LAM. Hiện tượng kháng ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm thấy khoảng trên 28% ở những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm [26,29,39]. Asparagine (N) được thay bởi Threonine (T) tại codon 236 trên vùng RT (rtN236T) và alanine (A) được thay bằng Valine (V) hoặc Threonine (T) tại codon 181 trên vùng RT (rtA181V/T) được nhận biết là kháng ADV [38]. Trên thực tế, có nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện đột biến như phương pháp dựa vào kiểu hình, phương pháp dựa vào kiểu gen. Phương pháp dựa vào kiểu gen bao gồm phương pháp lai mẫu dò Southern blot (Southern, 1975), giải trình tự trực tiếp, tạo dòng, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), Oligonucleotide Microarrays, PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi bằng polymerase; Karl Mullis và cộng sự, 1985), phương pháp real-time PCR,… và mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng. Tuy nhiên, do tính ưu việt của phương pháp real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác, không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chúng tôi chọn real- time PCR để phát hiện các đột biến kháng ADV ở HBV trong huyết thanh của những bệnh nhân viêm gan B mãn. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi chọn đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật real- time PCR”, nhằm phát hiện nhanh các đột biến kháng thuốc, với giá thành thấp sẽ có ý nghĩa trong công tác theo dõi và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B. Mục đích của đề tài: Xây dựng quy trình xác định các đột biến kháng thuốc Adefovir của HBV tại rtA181V/T và rtN236T bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan probe, chi phí thấp để phát triển thành kit phục vụ quá trình điều trị viêm gan siêu vi B trong tương lai. Đối tượng nghiên cứu: Những bệnh nhân VGB mạn đã và đang được điều trị bằng ADV. Phạm vi nghiên cứu: Các phòng thí nghiệm, các trung tâm xét nghiệm và các bệnh viện thuộc địa bàn thành phố Hồ Chí Minh (Bệnh viện Đại học Y Dược, Trung tâm Y khoa Medic, Phòng thí nghiệm Công ty Việt Á...). Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn của đề tài: Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu của các bệnh viện và cơ sở y tế ứng dụng phương pháp giải trình tự và PCR để phát hiện các đột biến kháng thuốc của HBV ở những bệnh nhân viêm gan B mãn đã và đang được điều trị, trong đó có đột biến kháng ADV tại vị trí rtA181T/V và rtN236T. Tuy nhiên, giá thành cho mỗi mẫu xét nghiệm bằng giải trình tự là khá cao. Do vậy, có một quy trình xác định kháng Adefovir tại rtA181T/V và rtN236T đơn giản, chính xác, giá thành thấp là rất cần thiết. Để đáp ứng nhu cầu đó, chúng tôi xây dựng kỹ thuật real-time PCR nhằm phát hiện đột biến kháng Adefovir và đây là công trình chưa từng được công bố trước đây tại Việt Nam. Bố cục của đề tài: Mở đầu Chương 1 – Tổng quan tài liệu Chương 2 – Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu Chương 3 – Kết quả và thảo luận Chương 4 – Kết luận và kiến nghị Tài liệu tham khảo ...