Một số đặc điểm cấu trúc của protease HIV-1 tái tổ hợp

Trong bài viết này, chúng tôi tiến hành phân tích một số đặc điểm về cấu trúc của HIV-1PrHis, làm cơ sở cho các nghiên cứu sử dụng protease sàng lọc chất ức chế từ dược liệu Việt Nam ứng dụng trong điều trị bệnh nhân HIV/AIDS.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Một số đặc điểm cấu trúc của protease HIV-1 tái tổ hợpSINH2015,34(4):Một số đặc TAPđiểm CHIcấu trúccủaHOCproteaseHIV-1tái520-527tổ hợpDOI:10.15625/0866-7160/v37n4.7522MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚCCỦA PROTEASE HIV-1 TÁI TỔ HỢPNguyễn Thị Hồng Loan1,2, Nguyễn Văn Sáng2,Trịnh Hồng Thái1,2, Phan Tuấn Nghĩa1,2, Bùi Phương Thuận1,2*1Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein,Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, *thuanbp@vnu.edu.vn2Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà NộiTÓM TẮT: Protease tái tổ hợp của HIV-1 (HIV-1PrHis) được tạo ra dưới dạng protein dung hợpchứa 114 gốc axit amin, bao gồm chuỗi peptide của protease HIV-1 (99 gốc axit amin), trình tựnhận biết của protease virus Etch thuốc lá (TEV, 7 gốc axit amin) và 6 gốc histidine, có khối lượngphân tử gần 12,8 kDa. Các kết quả phân tích cấu trúc bậc một bằng khối phổ MS/MS đã khẳngđịnh trình tự axit amin của protease hoàn toàn (100%) tương đồng với trình tự axit amin như tínhtoán lý thuyết. Cấu trúc bậc hai của protease HIV-1 có dạng gấp nếp β (β sheet) rõ rệt với đỉnh phổâm tại bước sóng 205 nm và cường độ gần -8 mdeg bằng phương pháp phổ CD (circularDichroism). Bằng việc sử dụng phần mềm SWISS-MODEL và các cấu trúc protease HIV-1 đãcông bố, cấu trúc 3D của HIV-1PrHis đã được dự đoán với các chỉ số tin cậy như TM-score0,9982; chỉ số Z-core này tối ưu so với Z-core của các cấu trúc protein thu được từ phương phápNMR và X-ray; hầu hết các góc Phi và Psi đều nằm trong vùng tối ưu. Theo đó, HIV-1PrHis là mộthomodimer với dạng chủ yếu là phiến gấp nếp β. Kết quả nghiên cứu là cơ sở để sử dụng HIV1PrHis trong việc sàng lọc các chất ức chế của enzyme.Từ khóa: cấu trúc protease, cấu trúc 3D, HIV-1, protease HIV-1, ức chế protease.MỞ ĐẦUHIV-1 là virus gây hội chứng suy giảmmiễn dịch mắc phải AIDS ở người. Protease củaHIV-1 là một trong các enzyme có vai trò thiếtyếu trong sự hình thành thể virus và vì vậy đượcxem là một trong những đích chính để phát triểncác thuốc ức chế protease (PI), chống HIV-1[4].Cho đến nay, Cục Thực phẩm và Thuốc củaHoa Kỳ (FDA) đã cấp phép 9 loại thuốc PI chođiều trị bệnh nhiễm HIV/AIDS. Tuy nhiên,nhiều tác dụng phụ khi sử dụng thuốc kéo dài vàkháng thuốc là vấn đề đối với thuốc PI nói riêngvà các thuốc điều trị HIV/AIDS nói chung.Chính vì vậy, các nghiên cứu phát triển thuốcmới hiệu quả hơn vẫn đang được tiến hành vàprotease HIV-1 trở thành một trong các enzymeđược nghiên cứu nhiều nhất [4, 7]. Hầu hếtprotease HIV-1 đều được tạo ra bằng con đườngtái tổ hợp. Gần đây, nhóm nghiên cứu củachúng tôi đã thiết lập được quy trình biểu hiệnvà tinh sạch một protease tái tổ hợp từ chủngHIV-1 phân nhóm CRF01_AE gây bệnh chủyếu ở người Việt Nam. Protein tạo ra dưới dạng520dung hợp chứa 114 gốc axit amin, bao gồmchuỗi peptide của protease HIV-1 (99 gốc axitamin), trình tự nhận biết của protease virus Etchthuốc lá (TEV, 7 gốc axit amin) và 6 gốchistidine, có khối lượng phân tử (KLPT) gần12,8 kDa, ký hiệu HIV-1PrHis [5]. Trongnghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân tíchmột số đặc điểm về cấu trúc của HIV-1PrHis,làm cơ sở cho các nghiên cứu sử dụng proteasesàng lọc chất ức chế từ dược liệu Việt Nam ứngdụng trong điều trị bệnh nhân HIV/AIDS.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUChế phẩm protease HIV-1 tái tổ hợp (HIV1PrHis) là sản phẩm của đề tài cấp Nhà nước,mã số ĐT-PTNTĐ.2012-G/02, được tạo ra theoquy trình công bố trước đây [5].Thang chuẩn protein (BNPM50) củaBionexus (Hàn Quốc); gel Q-sepharose, NiSepharose, Sephacryl S100 được mua từ GEHealthcare (Hoa Kỳ); các IPG strip pH 3-10,chiều dài 7cm của Biorad (Hoa Kỳ). Cácpeptide chuẩn Insulin B, Bradikinin, AgiotensinII, ACTH, chất nền CHCA (α-Cyano-4-Nguyen Thi Hong Loan et al.hydroxycinnamic acid) chuyên dùng cho nghiêncứu proteomics từ Sigma Aldrich (Hoa Kỳ).Enzyme trypsin, chymotrypsin, elastase đạt độsạch phân tích trình tự của Promega (Hoa Kỳ).Các hóa chất khác (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonicacid(CHAPS),urea,Thiourea(Invitrogen),dithiothreitol (DTT), Iodoacetamide (Biorad),SDS, Acylamide (USB-Pharmacia) đều đạt độtinh sạch dành cho nghiên cứu sinh học phân tử.Chế phẩm HIV-1PrHis được tái tinh sạchqua cột sắc ký lọc gel Sephacryl S 100 đểchuyển sang hệ đệm thích hợp cho phân tíchcấu trúc bậc 2. Cụ thể: 126 ml gel Sephacryl S100 (GE Healthcare) được nhồi vào cộtXK16/70 (GE Healthcare) đạt 63 cm chiều caocột trên hệ thống máy tự động AKTAprimer(GE Healthcare). Cột được cân bằng với 3 lầnthể tích đệm phosphate kali 20 mM, pH 8,0chứa NaCl 50 mM (đệm E) với tốc độ 0,5ml/phút. Tiếp theo, 5 ml protease HIV-1 hồitính, nồng độ 0,4 mg/ml được cho lên cột. Cộtđược rửa chiết bằng 2 lần thể tích đệm E để thunhận lại protease HIV-1.Phân tích cấu trúc bậc 1 của HIV-1PrHisbằng khối phổ MS/MSBăng protein của HIV-1PrHis KLPT 12,8kDa được cắt ra khỏi bản gel, tẩy màu và thuỷphân thành các peptide nhờ các en ...