Một số phương pháp cụ thể thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN - Phương pháp 2

Phương pháp này giới thiệu cách đổ gel, lên mẫu và chạy gel giải trình tự ADN. Có nhiều cách đổ gel, có thể tham khảo các cách khác nhau để chọn cách tiện ích nhất. Điều quan trọng nhất là các bản kính phải được rửa sạch tuyệt đối.1, Mang găng tay và loại bỏ hết bột găng tay đi. Rửa bản kính một lần với nước nóng. Sau đó dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH. Lau bản kính với dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức năng tương đương. Sau đó rửa sạch lại...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Một số phương pháp cụ thể thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN - Phương pháp 2 Một số phương pháp cụ thể thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN – Phương pháp 2 Phương pháp 2. Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN Giới thiệu chung: Phương pháp này giới thiệu cách đổ gel, lên mẫu và chạy gel giải trình tựADN. Có nhiều cách đổ gel, có thể tham khảo các cách khác nhau để chọn cáchtiện ích nhất. Điều quan trọng nhất là các bản kính phải được rửa sạch tuyệt đối. 1, Mang găng tay và loại bỏ hết bột găng tay đi. Rửa bản kính một lần với nước nóng. Sau đó dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH. Lau bản kính với dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức năng tương đương. Sau đó rửa sạch lại bằng nước. 2, Rửa các bản kính với nước trao đổi ion sau đó dựng lên giá cho khô, tránh bụi bám vào kính. Lau với ethanol và dùng giấy Kimwipes hay ScottUtinity để lau cho sạch không tạo vết. Kiểm tra lại bụi bám vào kính để laucho sạch, sau đó kính được lau bằng lớp dịch Rain-X hay Sigmacott, GelSlick của hãng AT Biochem. Mục đích dùng chất này là giúp cho việc đổgel dễ dàng hơn và gel không bị dính vào các bản kính.3, Rửa lại bản đệm cách gel (spacer) với nước đặt vào dọc theo hai cạnh đốixứng của bản kính.4, Ghép hai bản kính với nhau. Đặt cẩn thận hai bản kính bằng nhau saocho hai bản spacer sát tận cuối bản gene (tạo mặt phẳng cùng với hai bảnkính). Nếu không đảm bảo mặt phẳng thì dễ bị chảy gel trong quá trình đổgel. Kẹp 2 cạnh của gel tại 3 vị trí.5, Chuẩn bị gel acrylamid 8% Long Ranger (Hoefer Rig).Trộn đều hỗn dịch: 16 ml Acrylamid Long Ranger (LR) 50%. 5 ml 10X TBE 70 ml 10M Urea (46 gam) Đưa đến thể tích 100 ml với nước Cho vào 800 µl 10% Ammonium persulphat. 50 µl TEMED. Quá trình polyme hóa được thực hiện trong 15 -20 phút.Chạy gel LR trong dải nhiệt độ 50-55oC, nhiệt độ cao hơn 55oC sẽ phá cácliên kết acrylamid LR gel là dạng cải biến cho gel acrylamid có một số ưuđiểm sau: Thứ nhất là LR gel với nồng độ cao hơn nhưng việc chạy gel thìcũng như gel có nồng độ thấp thông thường, ví dụ LR gel 5% tương đương4% gel acrylamid với bisacrylamid Thứ 2 là LR gel có khả năng phân giảicao hơn và chạy với tốc độ nhanh hơn 30-40% gel thông thường, gel LRkhô nhanh hơn và không bị dính.Một số chú ý khi thao tác:: Trộn gel nhẹ nhàng (tránh trộn mạnh).a. Hút dịch acrylamid bằng pitpet hay có thể dùng cốc đong.b. Đặt bản kính nghiêng 15o và đổ gel bằng cốc đong hay pipet. Kiểmc. soát tốc độ đổ gel bằng góc nghiêng. Tránh để dòng gel khi đổ ngắt quãng vì điều này sẽ dẫn đến tạo bọt. Nếu phải dừng lại để hút dịch mớ i vào syringer thì lúc đó phải hạ dần bản kính xuống vị trí nằm ngang trước khi dừng đổ gel. Sau đó lấy dịch gel mới vào syringer và tiếp tục đổ gel trước khi gel lên khỏi vị trí nằm ngang. Cứ thao tác như vậy đến khi đổ đầy bản gel. Nếu xuất hiện bọt khi đổ gel thì phải dừng lại ngay và nghiêng tấm kính để cho bọt khí đi lên, có thể gõ nhẹ tay vào bản kính để cho bọt khí đi lên hết. Phải loại hết bọt khí ra khỏi gel, sau đó mới tiếp tục đổ gel.6, Đặt gel nằm ngang và đưa cạnh bằng của lược răng cá mập vào gel, tạomột góc hơi nghiêng nhằm tránh tạo bọt khí. Chắc chắn rằng đã đặt cạnhbằng của lược vào phía trên của gel và phần răng cá mập sẽ nằm dọc theođỉnh của bản kính dài (lược sẽ nằm ngược với vị trí trong hình 1.10). Bổsung thêm gel và đẩy thêm lược vào đúng vị trí và cố định lược lại bằngkẹp để tránh xê dịch.7, Bao bọc gel với giấy nilon SaranWrap để tránh gel tiếp xúc với khôngkhí. Ngoài ra có thể thấm giấy lọc với đệm TBE để đậy lên. Điều này giữcho gel luôn ẩm và tránh gel tiếp xúc với oxy (oxy làm cản trở quá trìnhpolyme hóa).8, Quá trình polyme xảy ra từ 30 phút đến 1 giờ. Để xác định polyme hóacó thể hút một ít gel vào pipét pastuer và để cho đến khi quá trình polymehóa xảy ra. Hoặc có thể lấy gel cho vào ống falcon và đậy chặt nắp lại,trong nhiều trường hợp thì gel chỉ nên polyme hóa trong 15-20 phút hoặcnhanh hơn. Nếu quá trình polyme hóa không xảy ra thì lại phải tiến hànhrửa kính và đổ lại gel. Chú ý nhiều khả năng quá trình polyme hóa khôngxảy ra do Ammonium persulphat không còn tốt khi dùng lâu, nên chuẩn bịdịch này để dùng trong tuần. Điều cần chú ý nữa là gel phải được bọc kỹvới SaranWrap để qua đêm.9, Chuẩn bị gel trước khi chạy:a. Lấy SaranWrap ra khỏi gel.b. Đặt gel vào thiết bị điện di (bản kính dài đặt áp vào thiết bị), chắc chắn làđã cắt bỏ lớp băng dính ở đáy gel để việc điện di xảy ra.c. Đổ 0,5X TBE vào bể đệm dưới của thiết bị, lượng đệm cần phải đủ đểcho bản gel nằm trong đệm.d. Đổ đệm vào bể trên của thiết bị, đảm bảo gel nằm dưới lớp đệm. Kiểmtra xem đệm có bị chảy ra hay không.e. Chạy thử 20-30 phút tại hiệu điện ...