Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 1

Chuẩn bị thành tế bào 1. Tế bào ướt (1-2 ml) + 5ml nước cất vô trùng + hạt thủy tinh (loại lớn và nhỏ, đường kính 0.11-0.12mm). Phá tế bào bằng sóng siêu âm ca.180 trong 1- 1.5 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong. Chuyển sang ống falcon 50ml. Nếu ngừng công việc ở đây, giữ mẫu ở 4oC. 2. Ly tâm với tốc độ 3000g trong 30 phút. Chuyển dịch trên sang ống ly tâm tốc độ cao (có nắp đậy bên trong). Ly tâm với tốc độ 17000rpm trong 30 phút. Bỏ dịch...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 1 Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 1C huẩn bị thành tế bào Tế bào ướt (1-2 ml) + 5ml nước cất vô trùng + hạt thủy tinh (loại lớn và 1. nhỏ, đường kính 0.11-0.12mm). Phá tế bào bằng sóng siêu âm ca.180 trong 1- 1.5 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong. Chuyển sang ống falcon 50ml. Nếu ngừng công việc ở đây, giữ mẫu ở 4oC. Ly tâm với tốc độ 3000g trong 30 phút. Chuyển dịch trên sang ống ly tâm 2. tốc độ cao (có nắp đậy bên trong). Ly tâm với tốc độ 17000rpm trong 30 phút. Bỏ dịch trên. Thêm 3ml SDS 4% (SDS có tác dụng loại lipid và protein). Nếu dừng 3. công việc ở đây, giữ mẫu ở nhiệt độ phòng. Giữ ở 100oC trong 40 phút, nhớ vặn chặt nắp. 4. Ly tâm với tốc độ 17000 rpm trong 30 phút ở 30oC (nếu giữ ở nhiệt độ 5. thấp, SDS sẽ bị kết tinh). Loại bỏ dịch trên. Rửa với nước ít nhất 3 lần với điều kiện giống trên (17000rpm, 30 phút) 6. Nếu cần thiết, xử lý bằng RNase và DNase. 7. Đông khô qua đêm. 8.Phân tích thành phần acid amin trong thành tế bào 2-3mg thành tế bào + 200µl HCl 4N, vặn chặt nắp, giữ ở 100oC qua đêm1. Làm khô bằng hút chân không (khoảng 1 ngày 1 đêm)2. Thêm 200 µl nước cất, trộn đều, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc3. độ 12000 rpm trong 5 phút. Lọc mẫu. Chạy sắc ký bản mỏng TLC:4. - Dung môi: Methanol 80ml Nước cất 17.5ml 6N HCl 4 ml Pyridine 10ml - Cellulose TLC Chuẩn (1µl): DAP, Ala, Gly, Glu, Lys - Mẫu: 3-5µl - Nhận biết bằng phun ninhydrin, giữ ở 100oC trong 5 phút. Các acid - amin sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu tím. Để lâu, các chấm này dần dần biến mất, nhưng riêng chấm của DAP sẽ chuyển sang màu vàng. Chuẩn bị mẫu chạy HPLC: chuẩn bị cho cả mẫu và chuẩn5. 10-20 µl (25nmol) mẫu, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h)- Thêm 20 µl Ethanol/DW/Triethylamine 2/2/1, trộn đều, làm khô bằng hút- chân không (khoảng 2h) Thêm 20 µl Ethanol/DW/Triethylamine/Phenylisothiocyanate 7/1/1/1, trộn- đều, giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h) Thêm 0.5ml dung dịch A(dich chạy HPLC), lọc mẫu dùng làm mẫu chạy- HPLCĐiều kiện chạy HPLC Độ hấp thụ (absorbance) 0.01- Sử dụng UV detector ở bước sóng 254nm- Dung dịch A: 6% CH3CN, dung d ịch B: 60% CH3CN- Tốc độ dòng chảy: 1ml/phút -Chương trìnhThời gian Nồng độ dung dịch(phút) B(%)0 015 7015.1 10025 10025.1 0 Dừng30 Phân tích thành phần menaquinone 100-500mg tế bào khô + 10-15 ml Chloroform: methanol (2:1), trộn bằng 1. khuấy từ chậm trong 2-3 giờ. Chuyển sang ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5-10 phút, lấy dịch trên, làm 2. khô bằng cô quay Hòa tan bằng 1,5 ml acetone, chuyển sang ống eppendorf, làm khô bằng hút3. chân không Thêm 50 µl ethanol, chấm toàn bộ mẫu lên bản TLC silicagel, tránh ánh sáng4. và nhiệt độ cao( không làm khô mẫu bằng máy sấy). Dung môi chạy TLC: Toluen. Sau đó, kiểm tra menaquinone bằng tia UV5. (thường nằm dưới vạch màu vàng có thể nhìn thấy bằng mắt thường). Chuẩn: Vitamin K. Vạch ngang với vitamin K là menaquinone. Cạo vạch đã được nhận biết bằng UV, cho vào ống eppendorf, thêm 1,5ml6. acetone, trộn đều. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng Nitơ7. lỏng. Thêm 50-100 µl ethanol, lọc và dùng làm mẫu chạy HPLC và Mass8. spectrometer (MS) Điều kiện chạy HPLC9.- Dung môi: Methanol: Propanol (2:1) Tốc độ dòng chảy: 0.2ml/min- Nhiệt độ cột: 40 oC- Nhận biết bằng UV detector với bước sóng 275 nm -Sau khi phân tích, ứng với mỗi pick trên LC, sẽ có pick trên MS. Chỉ số của MSchính là chỉ số m/z, sau đó trừ đi 1(vì MS thêm vào 1 proton), rồ i so với giá trị trongbảng sẽ biết được là loại menaquinone nào. Quan trọng nhất là pick cuối c ùng và caonhất (vì menaquinone rất dễ bị đứt gãy). VD: MK-9 (H4) có nghĩa là menaquinone cóchứa 9 đơn vị isoprene, trong đó có hai đơn vị isoprene bão hòa. Menaquinone này cóthể bị đứt gãy dễ dàng nên xuất hiện các pick nhỏ hơn. Xạ khuẩn có MK 7,8,9,10,11.Một vài loại có MK12. Phân tích thành phần đường trong tế bào 30-50mg tế bào khô + 1ml H2SO4 1N, lắc nhẹ, vặn chặt nút, giữ ở 100oC 1. ...