Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryiab vào cây cà chua bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùng như một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryiab vào cây cà chua bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensTẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cryIAb VÀO CÂY CÀ CHUA(Lycopersicon esculentum Mill.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨNAgrobacterium tumefaciensLê Tấn Đức1*, Phạm Đức Trí1, Nguyễn Hữu Hổ1, Hà Trần Minh Dũng1, Dương Thị Ngọc Thi2(1)Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)tanduc2007@gmail.com(2)Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp công nghệ cao tp Hồ Chí MinhTÓM TẮT: Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersiconesculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùngnhư một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAbchứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb. Chúng tôi nghiên cứu một vài yếutố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen cà chua như nồng độ của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vànồng độ acetosyringone trong quá trình xâm nhiễm. Để phục vụ cho việc chuyển gen, lá mầm 10 ngày tuổiđược dùng làm nguyên liệu. Sau 2 ngày xử lí chuyển gen lá mầm được rửa và cấy trên môi trường tái sinhMS có chứa chất sinh trưởng IAA (0,5 mg/l), BA (2 mg/l), chất chọn lọc kanamycin (100 mg/l) và 500mg/l kháng sinh cefotaxime để diệt vi khuẩn. Sau vài tuần chọn lọc trong môi trường trên, các chồi khángchất chọn lọc kanamycin sẽ được chuyển sang môi trường MS để phát triển và tạo rễ. Sự biểu hiện củagen GusA được kiểm tra bởi chất chỉ thị X-Glu. Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb trong cây càchua giả định chuyển gen đã được khẳng định bằng kỹ thuật PCR. Sự biểu hiện của độc tố tạo bởi genkháng sâu cryIAb trong lá cây cà chua giả định chuyển gen đã được kiểm tra bởi Kit Quickstix strip củacông ty Envirologix (Mỹ).Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Lycopersicon esculentum, chuyển gen, plasmid, lá mầm, gen cryIA,PCR.MỞ ĐẦUCà chua là một loại rau ăn quả được trồngrất phổ biến ở nhiều nước. Đây là loại rau quảđược ưa thích vì phẩm chất ngon và dễ chế biến.Tính đa dụng và nhu cầu tiêu thụ cà chua tươingày càng lớn đã thúc đẩy sự phát triển cây càchua như một trong những loại cây trồng chính.Ngoài ra, trồng cà chua đã mang lại hiệu quảkinh tế khá cao.Ở Việt Nam, việc phát triển trồng cà chuacòn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh,tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích,do đó cà chua là loại rau quả được khuyến khíchphát triển. Tuy nhiên, cà chua thường bị hại bởisâu ăn lá, đục quả (Heliothis armigera vàSpodoptera litura). Một số loại thuốc hóa họcbảo vệ thực vật được áp dụng vào các giai đoạnkhác nhau của cà chua để bảo vệ cây trồngchống lại dịch hại. Tuy nhiên, dư lượng chấthóa học của các loại thuốc này có thể tác hạiđến người tiêu dùng.Có nhiều báo cáo về nghiên cứu chuyểngen trên cây cà chua như các tác giả Cortina etal. (2004) [2], Park et al. (2003) [11], Sarker etal. (2009) [12]. Trong những nghiên cứu này, lámầm và lá thật được dùng làm nguyên liệu choviệc chuyển gen cà chua thông qua vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens. Theo hướng nghiêncứu này, chúng tôi tiến hành chuyển gen khángsâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersiconesculentum Mill.) với hy vọng sự biểu hiện củagen chuyển cryIA sẽ có tác dụng góp phần làmgiảm tác hại của sâu hại cà chua.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUVật liệuSử dụng giống cà chua vô hạn TN386,TN148 của Công ty Trang Nông và giống HồngChâu của Công ty Sygenta.Phương phápMôi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấyMôi trường gieo hạt là 1/2MS [10] khôngchất điều hòa sinh trưởng.Môi trường tiền tái sinh là MS với vitaminB5 [7] có các chất điều hòa sinh trưởng 0,1 mg/lNAA, 1 mg/l BA.Môi trường tái sinh chồi từ lá mầm là MS với205Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thivitamin B5 có bổ sung các chất điều hòa sinhtrưởng 1 mg/l IAA, 2 mg/l BA.Môi trường chọn lọc như môi trường táisinh có 100 mg/L kanamycin và 500 mg/lcefotaxime.Môi trường ra rễ là MS.Điều kiện nuôi cấy trong 9 giờ chiếusáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC.Dòng vi khuẩn, môi trường và điều kiệnnuôi cấySử dụng dòng vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens EHA 105 mang plasmidpCAMBIA2301 chứa gen cryIAb, gen gusA (cóintron, promoter CaMV35S) và gen nptII (khángkanamycin) với promoter CaMV35S. Môi trườnggiữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50 mg/lkanamycin. Để nhân giống cho nghiên cứuchuyển gen, vi khuẩn được nuôi lắc qua đêmtrong môi trường AB [3] cũng có nồng độkanamycin như trên và 50 mg/l rifamycin. Nhiệtđộ nuôi cấy ở 28oC.Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens với các nồng độkhác nhau đến khả năng chuyển genSử dụng dịch vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens với nồng độ OD ở bước sóng 600nm là 0,5; 1 và 1,5 trong quá trình chuyển genvới giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử líchuyển gen, các mẫu lá mầm được nhuộm ...