Nghiên cứu định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bài viết tiến hành nghiên cứu xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha động sử dụng acetonitril - đệm KH2PO4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 340 nm và tốc độ dòng 0,8 ml/phút.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CURCUMIN VÀ PIPERIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Phạm Thị Phương*; Nguyễn Quỳnh Ngọc*; Phạm Thị Thanh Hương* Đào Văn Đôn*; Nguyễn Thị Thanh Phương** TÓM TẮT Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha động sử dụng acetonitril đệm KH2PO4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 340 nm và tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Cả 2 chất đã được tách hoàn toàn trong thời gian 10 phút. Giới hạn định lượng của curcumin và piperin là 0,06 và 0,08 µg/ml. Diện tích pic và nồng độ các chất có mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ 1. Phương pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Tỷ lệ thu hồi cả 2 chất từ 93 - 100%. Phương pháp này được sử dụng để định lượng curcumin và piperin trong chế phẩm chứa curcumin và piperin. * Từ khóa: Curcumin; Piperin; HPLC; Định lượng. SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF CURCUMIN AND PIPERINE IN SUPPLEMENT BY HPLC SUMMARY A HPLC method for the simultaneous quantification of curcumin and piperine in supplements was validated. Using acetonitrile and buffer KH2PO4 50 mM (60/40, v/v) as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 nm, 5 µm) column, UV detection at 340 nm and flow at 0.8 ml/min, curcumin and piperine were separated satisfactorily within 10 minutes. The quantitation limits of curcumin and piperine were 0.6 µg/ml and 0.8 µg/ml. The calibration curve of each analyte had a correlation coefficient close to 1. The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were 93 - 100% for both curcumin and piperine. * Key words: Curcumin, Piperine, HPLC; Quantification. ĐẶT VẤN ĐỀ Curcumin là hoạt chất chính của Nghệ vàng (Curcuma longa L.) [1]. Curcumin có tác dụng sinh học ưu việt như: ức chế sự phát triển của khối u, tăng khả năng miễn dịch, chất chống oxy hóa mạnh, chữa một số bệnh tiêu hóa, gan mật, kháng khuẩn, chống viêm… Curcumin rất kém tan trong nước (độ tan 0,001%) và sinh khả dụng đạt 2 - 3%. Các nghiên cứu cho thấy: piperin làm tăng sinh khả dụng của curcumin lên * Học viện Quân y ** Trung tâm Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com) Ngày nhận bài: 13/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/07/2014 Ngày bài báo được đăng: 28/07/2014 7 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 20 lần [2, 3]. Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đã xuất hiện những sản phẩm kết hợp curcumin và piperin (tỷ lệ khoảng 100:1) nhưng vẫn chưa có phương pháp định lượng đồng thời 2 chất trên. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu nhằm: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp HPLC. NGUYÊN VẶT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu. * Hóa chất, nguyên liệu: - Chất chuẩn: curcumin chuẩn (96,3%, Himedia Laboratories, Ấn Độ), piperin chuẩn (99,0%, Sigma- Aldrich). - Mẫu thử: chế phẩm chứa curcumin và piperin. - Methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC (Merck). - Dung môi, hóa chất khác: KH2PO4, H3PO4, nước cất… đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. * Thiết bị và dụng cụ phân tích: - Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D, 4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). - Cân phân tích Sartorius độ chính xác ± 0,1 mg, máy lắc siêu âm, máy đo pH, các dụng cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ chính xác phù hợp. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. - Khảo sát quy trình định lượng. + Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [5, 6], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu như sau: 8 Cân chính xác lượng bột tương đương với khoảng 50 mg curcumin, thêm khoảng 40 ml MeOH, lắc đều. Chiết siêu âm trong 20 phút. Để nguội, chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 50 ml. Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc lấy dịch lọc. Lấy 1 ml dịch lọc đem bốc hơi ở nhiệt độ phòng tới cắn. Hòa tan cắn trong 10 ml pha động. Lọc qua màng lọc 0,45 µl trước khi phân tích bằng HPLC. + Điều kiện sắc ký [5, 6]: Cố định các điều kiện: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm); detector PDA; thể tích bơm mẫu 50 µl; tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Khảo sát pha động với hệ dung môi MeOH:nước và đệm KH2PO4:ACN. - Thẩm định quy trình định lượng. Thẩm định quy trình định lượng theo hướng dẫn của Bộ Y tế [4] gồm các chỉ tiêu: tính tương thích của hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác, độ đúng. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Khảo sát quy trình định lƣợng. Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo sát điều kiện sắc ký và ghi sắc ký đồ. Phân tích kết quả và lựa chọn được điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời curcumin và piperin như sau: cột sắc ký: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector PDA, ghi phổ ở 340 nm. ...