Nghiên cứu định lượng stevioside trong cỏ ngọt (stevia rebaudiana) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Với mục đích góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu cỏ ngọt ở Việt Nam, bài viết này tập trung nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng stevioside trong cỏ ngọt bằng HPLC. Đồng thời, ứng dụng phương pháp để đánh giá hàm lượng của Stevioside trong một số mẫu cỏ ngọt thu mua trên thị trường.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu định lượng stevioside trong cỏ ngọt (stevia rebaudiana) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng caoTẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG STEVIOSIDE TRONG CỎ NGỌT(STEVIA REBAUDIANA) BẰNG PHƢƠNG PHÁPSẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAOVũ Bình Dương*; Chử Văn Mến*; Nguyễn Văn Long*Vũ Tuấn Anh*; Nguyễn Đức Thiện**TÓM TẮTSắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp mới và đơn giản để định lượngstevioside trong cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, họ Cúc - Asteraceae) được phát triển và thẩm địnhđầy đủ. Phương pháp này áp dụng vào phân tích hàm lượng stevioside trong các mẫu cỏ ngọtthu mua ở các nguồn khác nhau. Kết quả cho thấy hàm lượng của stevioside trong cỏ ngọt thayđổi nhiều giữa các mẫu (dao động 6,44 - 33,97 mg/g tùy theo nguồn thu hái).* Từ khóa: Cỏ ngọt; Stevioside; HPLC.DETERMINATION OF STEVIOSIDE IN STEVIA REBAUDIANABY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHYSUMMARYA new and simple high performance liquid chromatography method for the quantitative analysisof stevioside in Stevia (Stevia rebaudiana) was developed and fully validated. The method wasapplied to analyze stevioside in Stevia. The results showed that the content of stevioside washighly fluctuated among samples collected from markets.* Key words: Stevia; Stevioside; HPLC.ĐẶT VẤN ĐỀCỏ ngọt (Stevia rebaudiana) là dược liệucó nguồn gốc từ Paraguay, được nhậpnội và trồng phổ biến ở Việt Nam [1]. Lácỏ ngọt chứa một số glycoside loại diterpen [2], có độ ngọt gấp 300 lần đườngmía. Cỏ ngọt có vị ngọt rất đậm, có íchcho người đái tháo đường và béo phì [1].Dịch chiết cỏ ngọt cho nhiều tác dụngdược lý tốt như điều hòa huyết áp [3], hạđường huyết [4], kháng khuẩn [5] và hoạttính thụ thai [6].Stevioside là hoạt chất chính trong cỏngọt với hàm lượng cao và độ ngọt mạnh.Hiện nay, Học viện Quân y đang bào chếmột số chế phẩm có sử dụng nguyên liệutừ cỏ ngọt. Hàm lượng hoạt chất bị ảnhhưởng bởi nhiều yếu tố như nguồn gốc,thu hái, đất trồng, mùa thu hoạch và cáchchế biến. Để đảm bảo chất lượng cho cácsản phẩm, việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu* Học viện Quân y** Cục Y tế, Bộ Công anNgười phản hồi (Corresponding): Vò B×nh D-¬ng (vbduong2978@gmail.com)Ngày nhận bài: 15/02/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/04/2014Ngày bài báo được đăng: 15/04/201413TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014đầu vào rất quan trọng. Với mục đích gópphần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu cỏ ngọtở Việt Nam, tiến hành xây dựng và thẩmđịnh phương pháp định lượng steviosidetrong cỏ ngọt bằng HPLC. Đồng thời, ứngdụng phương pháp để đánh giá hàmlượng của Stevioside trong một số mẫucỏ ngọt thu mua trên thị trường.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Hóa chất và thiết bị.* Hóa chất và nguyên vật liệu:Stevioside chuẩn (98%, Sigma Andrich).Acetonitrile, methanol, nước cất, axítphosphoric đạt tiêu chuẩn cho sắc ký lỏnghiệu năng cao, các hóa chất khác đạt tiêuchuẩn phân tích.* Thiết bị:Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu,bao gồm bơm LC-20AD, detector SPD-20AUV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A (Shimadzu,Nhật Bản).2. Phương pháp nghiên cứu.* Điều kiện sắc ký:Cột: cột phân tích pha đảo OptimapakC18 (150 x 4,6 mm; 5 μm), Công tyRStech Corp, Hàn Quốc; bước sóng pháthiện 200 nm; pha động gồm dung dịchaxít phosphoric 0,1% trong nước vàacetonitrile với chương trình đẳng dòng33% B trong 30 phút; tốc độ dòng 1,0ml/phút, thể tích tiêm 10 μl.* Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử:Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc đượcchuẩn bị bằng cách hòa tan steviosidevào hỗn hợp methanol:nước (50:50) đểcó nồng độ 2,5 mg/ml. Các dung dịchchuẩn làm việc được chuẩn bị bằng cáchpha loãng dung dịch gốc stevioside đếnnồng độ thích hợp.Mẫu thử: cỏ ngọt khô được nghiền tớibột mịn, cho qua rây, trộn đều, cân chínhxác 1,0 gram bột, cho vào bình định mức10 ml, thêm hỗn hợp methanol:nước(30:70), lắc đều, bổ sung 30% methanoltới vạch. Cân chính xác khối lượng, chiếtsiêu âm trong 60 phút ở 30oC, lấy ra, cânlại và bổ sung hỗn hợp methanol: nước(30:70) tới khối lượng ban đầu, lắc kỹ, lọcqua màng 0,45 µm, dịch lọc được dùngđể tiêm mẫu.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀBÀN LUẬNVới điều kiện sắc ký và phương phápxử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thuđược cho các pic tách rõ ràng, nhiễu nềnthấp thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thửcỏ ngọt và mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ,mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gianlưu của pic stevioside trong sắc ký đồ củamẫu chuẩn với thời gian lưu 6,48 phút(hình 1). Tại thời gian lưu pic steviosidetrên sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn, đã sosánh phổ hấp thụ UV thu được của pic.Kết quả cho thấy phổ mẫu thử và mẫuchuẩn trùng khít lên nhau với hệ số phùhợp 0,9998. Điều này chứng tỏ: pic thuđược trên sắc ký đồ của mẫu thử tinhkhiết và các thành phần khác có trongmẫu thử không ảnh hưởng đến quá trìnhphân tích stevioside, qua đó cho phéptiến hành định tính, định lượng.15TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014Hình 1: Sắc ký đồ của chuẩn ...