Nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật nuôi cấy đơn bào ký sinh và gây bệnh

Vấn đề nuôi cấy amíp trong phòng thí nghiệmđã đ−ợc chú ý từ lâu. Đến năm 1918 hai tác giả lμBoeck vμ Drbohlav đã tìm ra môi tr−ờng để nuôicấy amíp gây bệnh Entamoeba histolytica.ở Việt Nam trong những năm tr−ớc đây cũng đãcó một số cơ sở trong đó có Bộ môn Ký sinh trùngTr−ờng Đại học Y Hμ Nội đã nghiên cứu nuôi cấy E.histolytica bằng môi tr−ờng Palova vμ thu đ−ợcnhững kết quả nhất định. Tuy nhiên việc nuôi cấy rấtkhó khăn do thể hoạt động của amíp rất dễ chết nênvẫn ch−a nuôi cấy đ−ợc dμi...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật nuôi cấy đơn bào ký sinh và gây bệnh TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004 Nghiªn cøu hoµn chØnh kü thuËt nu«i cÊy ®¬n bµo ký sinh vµ g©y bÖnh Ph¹m TrÝ TuÖ, Ph¹m V¨n Th©n, Tr−¬ng ThÞ Kim Ph−îng, Ph¹m Ngäc Minh, Lª ThÞ TuyÕt Khanh, Cao V©n HuyÒn Bé m«n Ký sinh trïng, Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi §¸p øng yªu cÇu nu«i gi÷ dµi ngµy mét sè chñng ®¬n bµo phôc vô nghiªn cøu vµ gi¶ng d¹y, chóng t«i ®·tiÕn hµnh ®Ò tµi nµy vµ cã mét sè nhËn xÐt sau: 1. M«i tr−êng Palova cã thÓ sö dông tèt ®Ó nu«i gi÷ E. histolytica vµ mét sè lo¹i ®¬n bµo kh¸c nh−: E.gingivalis, Acanthamoeba, T. vaginalis. Nh÷ng yÕu tè ®¶m b¶o cho sù ph¸t triÓn tèt cña ®¬n bµo trong nu«icÊy lµ: nhiÖt ®é, tû lÖ huyÕt thanh ngùa, pH cña m«i tr−êng vµ l−îng tinh bét g¹o. 2. Quy tr×nh nu«i cÊy - NhiÖt ®é nu«i cÊy lu«n gi÷ æn ®Þnh ë 370C. - §¶m b¶o ®iÒu kiÖn v« trïng trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy. - M«i tr−êng nu«i cÊy thÝch hîp cho sù ph¸t triÓn cña ®¬n bµo: + Tû lÖ huyÕt thanh ngùa: 10%. + pH cña m«i tr−êng nu«i cÊy: 6 - 6,5. + L−îng tinh bét g¹o: 5mg/1 èng nu«i cÊy. - Khi cÊy truyÒn, lÊy ë r×a ®¸y èng m«i tr−êng cã nhiÒu ®¬n bµo nhÊt. - Thêi gian cÊy truyÒn tèt nhÊt lµ ngµy ®¬n bµo cã mËt ®é cao nhÊt vµ ho¹t ®éng kháe. Víi nu«i cÊy amÝp: + Ngµy thø 2 (3 lÇn cÊy ®Çu). + Ngµy thø 3 (c¸c lÇn cÊy sau). - Víi quy tr×nh nµy (tÝnh ®Õn th¸ng 7 n¨m 2004), chóng t«i ®· nu«i gi÷ ®−îc 12 mÉu ®¬n bµo thuéc c¸c gièng:Entamoeba, Acanthamoeba vµ Trichomonas víi thêi gian tõ 6 ®Õn 24 th¸ng vµ hiÖn vÉn ®ang ph¸t triÓn tèt. i. §Æt vÊn ®Ò ®· tiÕn hµnh ®Ò tµi: “Nghiªn cøu hoµn chØnh kü VÊn ®Ò nu«i cÊy amÝp trong phßng thÝ nghiÖm thuËt nu«i cÊy ®¬n bµo ký sinh vµ g©y bÖnh” nh»m®· ®−îc chó ý tõ l©u. §Õn n¨m 1918 hai t¸c gi¶ lµ c¸c môc tiªu sau:Boeck vµ Drbohlav ®· t×m ra m«i tr−êng ®Ó nu«i 1. X¸c ®Þnh mét sè yÕu tè chñ yÕu ¶nh h−ëngcÊy amÝp g©y bÖnh Entamoeba histolytica. ®Õn nu«i cÊy ®¬n bµo. ë ViÖt Nam trong nh÷ng n¨m tr−íc ®©y còng ®· 2. X©y dùng qui tr×nh nu«i cÊy ®¬n bµo th−êng qui ¸p dông trong Labo ®Ó gi÷ c¸c chñng ®¬n bµocã mét sè c¬ së trong ®ã cã Bé m«n Ký sinh trïng nu«i cÊy dµi ngµy.Tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi ®· nghiªn cøu nu«i cÊy E.histolytica b»ng m«i tr−êng Palova vµ thu ®−îc ii. ®èi t−îng, vËt liÖu vµ ph−¬ngnh÷ng kÕt qu¶ nhÊt ®Þnh. Tuy nhiªn viÖc nu«i cÊy rÊt ph¸p nghiªn cøukhã kh¨n do thÓ ho¹t ®éng cña amÝp rÊt dÔ chÕt nªn 1. §èi t−îngvÉn ch−a nu«i cÊy ®−îc dµi ngµy [1]. 1.1. Quy tr×nh nu«i cÊy §Ó ®¸p øng nh÷ng yªu cÇu cÇn thiÕt ph¶i nu«i TiÕn hµnh nghiªn cøu theo quy tr×nh cñagi÷ dµi ngµy c¸c chñng ®¬n bµo ký sinh, chóng t«i Baillenger J trªn m«i tr−êng Palova [3]. 61 TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004 1.2. C¸c chñng ®¬n bµo nghiªn cøu 3.2. Kü thuËt pha m«i tr−êng Palova: pha theo c«ng thøc, ®iÒu chØnh pH = 6 - 6,5. Chia vµo c¸c - E. histolytica ph©n lËp tõ: ph©n bÖnh nh©n cã èng nu«i cÊy, mçi èng 5ml, hÊp tiÖt trïng. §Óhéi chøng lþ, tiªu ch¶y, rèi lo¹n tiªu hãa. Chóng nguéi vµ b¶o qu¶n trong tñ l¹nh.t«i ®· ph©n lËp ®−îc 4 mÉu bÖnh phÈm cã E.histolytica, ký hiÖu lµ H1, H2, H3, H4. MÉu H2 ®· 3.3. Kü thuËt nu«i cÊy [3], [6]lµm ph¶n øng PCR víi gen måi lµ E. histolytica vµ - CÊy bÖnh phÈm: sau khi lÊy bÖnh phÈm, xÐtcho kÕt qu¶ d−¬ng tÝnh. nghiÖm thÊy cã ®¬n bµo ph¶i tiÕn hµnh cÊy ngay - E. gingivalis: bèn mÉu bÖnh phÈm cã E. vµo m«i tr−êng (®· ®−îc lµm Êm) vµ ®Ó ë tñ Êm 370C.gingivalis ®−îc ph©n lËp tõ bùa r¨ng cña nh÷ngbÖnh nh©n viªm quanh r¨ng, ký hiÖu lµ G1, G2, G3 - CÊy truyÒn trªn m«i tr−êng: cÊy truyÒn liªnvµ G4. tiÕp tõ m«i tr−êng ®ang cÊy sang m«i tr−êng míi. - Acanthamoeba: hai mÉu bÖnh phÈm cã - §¸nh gi¸ kÕt qu¶ nu«i cÊy:Acanthamoeba ph©n lËp tõ m¶nh gi¸c m¹c cña + §¬n bµo sèng/chÕt.bÖnh nh©n bÞ viªm loÐt gi¸c m¹c, ký hiÖu lµ M1 ...