Nghiên cứu phân lập vi khuẩn và tách chiết enzym urease từ môi trường nuôi cấy helicobacter pylori

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dạ dày tá tràng (DD-TT); nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo kháng thể kháng urease.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu phân lập vi khuẩn và tách chiết enzym urease từ môi trường nuôi cấy helicobacter pyloriTẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014NGHIÊN CỨU PHÂN LÂP VI KHUẨN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYMUREASE TỪ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY HELICOBACTER PYLORIĐỗ Hoàng Long*; Đỗ Minh Trung*Lê Thu Hồng**; Lê Văn Đông*TÓM TẮTỨc chế enzym urease bằng kháng thể đặc hiệu theo đường uống là một hướng nghiên cứu mớitrong điều trị nhiễm Helicobacter pylori, nhằm đối phó với tình trạng vi khuẩn (VK) kháng kháng sinh.Nghiên cứu này được tiến hành nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dạ dày tá tràng (DD-TT);nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo khángthể kháng urease. Kết quả: đã phân lập được 17 chủng H. pylori từ 18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết,đạt tỷ lệ thành công 94,5%. Ba chủng H. pylori có hoạt độ urease cao được chọn và tăng sinh trongmôi trường Brucella broth. Tách chiết urease từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn vớiammonium sulfate 50% bão hòa. Sản phẩm thu được có hoạt tính urease và tương đối tinh khiết.Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính cho một băng đậm, tương ứng với tiểu đơn vịcó trọng lượng phân tử khoảng 60,3 kDa của urease.* Từ khóa: Urease; Helicobacter pylori; Tách chiết enzym.HELICOBACTER PYLORI ISOLATION AND UREASE EXTRACTION FROMCULTURE BROTH SUPERNATANTSUMMARYUrease inhibition with oral specific antibody is a new approach in treatment of Helicobacter pyloriinfection, coping with antibiotic resistance of this bacterium. This research aims to isolate H. pylorifrom gastric-peptic ulcer biopsies and extract urease from bacterial culture broth to be used asmaterial for the development of antibody to urease. 17 H. pylori strains were obtained from 18 biopsysamples (94.5%). Among them, three strains which showed highest urease activity were thensub-cultured in Brucella broth. Urease was extracted from culture supernatant by precipitation withammonium sulfate 50% saturation. The obtained product maintained urease activity and relativelypure. SDS-PAGE analysis in denature condition showed that, the urease contained product expressas a single band, corresponding with subunit B of urease with molecular masses of approximately60.3 kDa.* Key words: Urease; Helicobacter pylori; Enzyme extraction.* Học viện Quân y** Bệnh viện 103Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com)Ngày nhận bài: 28/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 8/12/2013Ngày bài báo được đăng: 18/12/201311TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014ĐẶT VẤN ĐỀViêm loét DD-TT là bệnh lý thường gặpở Việt Nam cũng như trên thế giới. Tỷ lệmắc bệnh này khá cao, 60 - 70% ở Việt Nam,còn ở các nước khác dao động từ 50 - 90%.Có nhiều nguyên nhân gây viêm loét DDTT, trong đó, nguyên nhân thường nhắcđến hiện nay là do nhiễm VK Helicobacterpylori, chiếm 75 - 95% [3, 5, 10]. Việc điềutrị viêm loét DD-TT do nhiễm H. pylori rấtphức tạp, vì phải sử dụng phác đồ phối hợpcác thuốc kháng sinh với thuốc giảm toan,giảm tiết đúng, đủ liều, đủ thời gian và đúngquy cách. Tuy nhiên, khả năng thất bại trongđiều trị rất lớn, do tình trạng VK kháng khángsinh [1, 6]. Xuất phát từ thực tế lâm sàng,nhu cầu tìm ra các thuốc mới có tác dụngức chế hoặc ngăn ngừa nhiễm H. pylorimà không lo ngại tình trạng kháng thuốc,trong đó có phương pháp miễn dịch trị liệuthụ động sử dụng kháng thể kháng trực tiếpH. pylori hoặc kháng enzym urease củaH. pylori, thành phần quan trọng trong quátrình sinh bệnh của H. pylori, giúp chúng nétránh, tồn tại và phát triển được trong môitrường axít của dịch dạ dày, là một việc làmtriển vọng [8]. Từ đó, nghiên cứu này đượctiến hành nhằm mục tiêu: Phân lập VK vàtách chiết urease từ H. pylori làm nguyên liệuchế tạo kháng thể đặc hiệu kháng urease.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Vật liệu nghiên cứu.18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết ổ loét DDTT qua nội soi của 18 bệnh nhân bị loétDD-TT đến khám tại phòng khám nội soitiêu hóa, Bệnh viện 103 từ tháng 12 - 2011và tháng 3 - 2012.Các hóa chất sinh phẩm: BHI (Brainheart infusion broth) (BioRad, Mỹ), Brucellabroth (Neogen Corporation, Mỹ), huyết thanhbào thai bê (FBS - Fetal bovine serum)(Gibco, Mỹ), Pylori agar (BioMérieux, Pháp)và túi ủ GENbag microear (BioMérieux, Pháp).2. Phương pháp nghiên cứu.* Phân lập và định danh H. pylori từ bệnhphẩm:Bệnh phẩm sinh thiết qua nội soi đượcbảo quản trong ống nghiệm chứa BHI brothvô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệmtại Bộ môn Khoa Vi sinh, Bệnh viện 103. Tạiđây, nghiền nát bệnh phẩm bằng dụng cụvô trùng và nuôi cấy phân lập chọn lọctrong đĩa petri chứa môi trường Pylori agarđặt trong túi vi hiếu khí GENbag microear(5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao) ở37oC. VK được phân lập sau 5 ngày nuôicấy và định danh bằng nhuộm Gram, cácphản ứng sinh hóa như oxidase, catalasevà urease [3, 5].* Nuôi cấy tăng sinh H. pylori và táchchiết urease từ dịch nuôi cấy:Nuôi cấy các c ...