Nghiên cứu tách vùng điều khiển D - loop Ty thể Gà ri, Gà mông và gà sao

Vùng điều khiển của DNA ty thể (Displacement loop hay D-loop) có tốc độ tiến hóa nhanh gấp 5-10 lần với các gen ty thể khác. Trình tự nuleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài. Trên thế giới và ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về vùng điều khiển D-loop ty thể của lớp chim, gà (Randi et al., 1997 [4]; Lê Đức Long et al., 2007 [3]...) để xác định tính đa dạng di truyền ở mức phân tử.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu tách vùng điều khiển D - loop Ty thể Gà ri, Gà mông và gà saoT¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008NGHIÊN CỨU TÁCH VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-loop TY THỂGÀ RI, GÀ MÔNG VÀ GÀ SAOBùi Thị Kiều Vân - Nguyễn Trọng Lạng (Trường ĐH Sư phạm - ĐH Thái Nguyên)1. Đặt vấn đềVùng điều khiển của DNA ty thể (Displacement loop hay D-loop) có tốc độ tiến hóanhanh gấp 5-10 lần với các gen ty thể khác. Trình tự nuleotide của vùng D-loop là một công cụrất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thểcùng loài. Trên thế giới và ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về vùng điều khiểnD-loop ty thể của lớp chim, gà (Randi et al., 1997 [4]; Lê Đức Long et al., 2007 [3]...) để xácđịnh tính đa dạng di truyền ở mức phân tử. Các giống gà nội (gà Ri, gà Mông...) và nhập nội (gàSao) thích ứng tốt với điều kiện chăn nuôi Việt Nam, phNm chất trứng, thịt tốt. Vì vậy việc táchchiết DNA tổng số, phân lập và tách dòng vùng điều khiển D-loop của ba giống gà này tạo điềukiện cho việc xác định trình tự vùng điều khiển D-loop là một việc làm cần thiết để xác định tínhđa dạng di truyền ở mức độ phân tử của các giống gà trên.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu2.1. Vật liệuVật liệu N/C là mẫu máu của các giống: gà Ri Hưng Yên (Rhy), gà Mông Nghệ An (Mna), gàSao dòng trung (Sdt), được nuôi trong trại giống của trường ĐHNL Thái Nguyên theo dự án gà sạch.2.2. Phương pháp nghiên cứuDNA tổng số được tách chiết từ máu gồm DNA nhân và DNA ty thể theo phương phápđược mô tả của (Huỳnh Thị Thu Huệ et al., 2005 [1]), nồng độ, độ sạch của DNA được xác địnhbằng điện di và phổ hấp thụ trên máy quang phổ (Hewlett Parkad, Mỹ).Phản ứng chuỗi poli merase (PCR) [3] thành phần: Nước 10,85µl; Buffer 2,5µl; MgCl24µl; dNTPs 2,5µl; Mồi H1255-F 0,5µl; Mồi L16725-R 0,5µl; Taq DNA polymerase 0,15µl;DNA temp 4µl; (tổng thể tích 25µl) thực hiện trên máy PCR - PTC100 (MJ Research, Mỹ). Chutrình nhiệt: 940C-4; (940C-1; 500C-1; 720C-1 20) x 30 chu kỳ; 720C-10; giữ ở 40C. Trình tựcặp mồi: L16725-F (Tm = 60 0 C) 5’-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3’;H1255-R (Tm=55 0 C) 5’-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3’.Các kỹ thuật sinh học phân tử để tạo DNA tái tổ hợp như tách chiết, tinh sạch DNAplasmid, xử lý DNA plasmid bằng enzim cắt hạn chế, gắn nối các đoạn DNA vào vector, điện diDNA trên gel agarose được tiến hành theo Sambrook và Russell (2001) [5].3. Kết quả nghiên cứu3.1.Tách chiết DNA tổng sốNhư đã mô tả, chúng tôi tách chiết được DNA tổng số của ba mẫu Rhy, Mna, Sdt. DNAtổng số được kiểm tra độ sạch bằng phổ hấp thụ tử ngoại và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.Kết quả cho thấy các mẫu đều sáng tập trung và rõ nét, không có những “mảnh vụn” tạonên vệt sáng kéo dài phía dưới. Hai băng DNA thu được có kích thước tương đương với vạch 21kb của marker DNA λ. Như vậy, có thể sơ bộ đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu vềnồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.67T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008Hình 1: Điện di DNA tổng số trên gel agarose0,8%.M: Thang DNA chun; 1; 2; 3 DNA tổngsố mẫu Rhy; Mna; SdtHình 2: Kết quả điện di sản phm PCRM: Marker; 1: Rhy; 2: Mna; 3: Sdt3.2. Phân lập vùng điều khiển D-loop của ba giống gà Ri, gà Mông và gà SaoChúng tôi tiến hành PCR từ DNA tổng số của 3 giống gà Rhy, Mna, Sdt sử dụng cặpmồi H1255-F và L16750-R. Theo ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNAnằm ở vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thước chuNn (marker), cho thấy kích thướcphân tử của sản phNm PCR vào khoảng 1,3 kb, Các băng đều sáng đậm, rõ nét, tập trung. Nhưvậy chúng tôi đã nhân được vùng D-loop (hình 2).3.3. Tách dòng vùng điều khiển D-loop của ba giống gà Ri, gà Mông và gà SaoSản phNm PCR được nối ghép vào vector pJET1/Blun sau đó được biến nạp vào tế bàoE. Coli, nuôi cấy trên môi trường agar giàu dinh dưỡng có bổ sung Amp, nuôi lắc qua đêm, chọnkhuNn lạc đơn dòng, tách chiết và tinh sạch plasmid. Kết quả trên hình 3 cho thấy các mẫu đềucó các dòng Rhy 2; Mna 4; Sdt 7; Sdt 9 cao hơn dòng đối chứng. Từ đây, có thể dự đoán cácdòng này có thể chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai.Hình 3. Ảnh điện di một số DNA plasmidtrên gel agarose 0,8%ĐC: DNA plasmid đối chứng (không được chènthêm đoạn DNA)1-3: DNA plasmid mẫu Rhy;4-6: DNA plasmid mẫu Mna;7-9: DNA plasmid mẫu SdtHình 4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằngXhoI và XbaIM: Thang DNA chuNn (DNA được cắt bằngEcoRI và Hind)1. Plasmid không được cắt;2. Sản phNm cắt của plasmid không có đoạn chèn3. Sản phNm PCR;4-5-6. Sản phNm cắt của dòng Rhy; Mna; SdtĐể xác định các dòng trên có được chèn vùng D-loop hay không chúng tôi tiến hành cắtkiểm tra các dòng Rhy 2; Mna 4; Sdt 9 bằng enzyme hạn chế XhoI và XbaI. Vì vectorpJET1/Blun có chứa điểm nhận biết của enzyme XhoI và XbaI ở gần hai vị trí ghép nối gen. Mặtkhác trên vùng D-loop ty thể lại không có điểm nhận biết của 2 enzyme này. Do vậ ...