Nghiên cứu tạo Panel DNA dùng kiểm định KIT PCR chẩn đoán vi khuẩn than và dịch hạch

Nghiên cứu này tiến hành tạo panel DNA dùng kiểm định kít PCR đa mồi chẩn đoán vi khuẩn than và dịch hạch. DNA được tách chiết từ các chủng than và dịch hạch được lưu giữ tại Học viện Quân y; chủng vi khuẩn E. coli, B. cereus được đặt mua tại công ty Microbiologies (Mỹ),
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu tạo Panel DNA dùng kiểm định KIT PCR chẩn đoán vi khuẩn than và dịch hạch NGHIÊN CỨU TẠO PANEL DNA DÙNG KIỀM ĐỊNH KIT PCR CHẨN ĐOÁN VI KHUẦN THAN VÀ DỊCH HẠCH Trần Danh Khới1, TS. Nguyễn Thái Sơn2, TS. Lê Thu Hồng 2 1 Trưởng Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương; 2 Học viện Quân y TÓM TẮT Nghiên cứu này tiến hành tạo panel DNA dùng kiểm định kít PCR đa mồi chẩn đoàn VI khuẩn than và dịchhạch. DNA được tách chiết từ các chửng than và dịch hạch được lưu giữ tại Học viện Quân y; chủng vi khuẩn E.coli, B. cereus được đặt mua tại công ty Microbiologies (Mỹ), kế t quả đã ‘tạo được bộ panel chứng Ơương DNAcủa than và dịch hạch, bộ panel DNA chứng âm với 2 loài vi khuần rất gần về mặt di truyền là B. cereus và E. coliđể kiểm tra phản ứng chéo đảnh giá độ đặc hiệu cùa phản ứng. Ngưỡng phất hiện cửa phẩn ứng chúng tôi xácđịnh được ở mức 92fg/ụl với DNA từ vi khuẩn than; 131fg/ụl với DNA từ VI khuẩn dịch hạch. Độ nhậy của bộ kítkhi kiểm định đạt 100% với cả 6 cặp gen đích vrrÁ, pagA, capA của vi khuẩn than và ypo2088, plã, cafa cùa vikhuần dịch hạch. Độ đặc hiệu của bộ kít khi kiểm định đạt 100% với 5 cặp gen đích pagA, capA của vi khuẩnthan và ypo2088, pla, cafa của vi khuẩn dịch hạch, riêng cặp gen vrrA của vi khuẩn than đã bắt dương tính 100%với nhiễm sắc thể của B.cereus. Từ khóa: Panel DNA, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, multiplex PCR. SUMMARY RESEARCH AND CREATE DNA PANELS EXAMINING THE QUANLITY OF PCR KITS FOR BACILLUSANTHRACIS AND YERSINIA PESTIS DIAGNOSTICS This study was conducted to create DNA panels for examining the quality o f PCR-based for Bacillus anthracisand Yersinis pestis diagnostics. DNA was extracted from B. anthracis and Y. pestis, which were kept at theMilitary Medical University. Echerichia coii and Bacillus cereus were obtained from Microbiologics inc. (USA). Thisstudy has created the DNA positive control panels for B. anthracis and Y. pestis. A negative control DNA panelwas created from B. cereus and E. coll, the two closely related bacteria to B. anthracis and Y. pestis to check forcross-reactivity in assessing the specificity o f PCR diagnosis B. anthracis and Y. pestis. The results revealed thatthe lowest detectable levẹl o f the reaction was 92fg/l with DNA from B. anthracis and 131fg/l with DNA from Y.pestis. The sensitivity o f the tested kits was 100% with 6 targeted genes (vrrA, pagA, capA fo r B. anthracis andypo2088, pla, cafA for Ỵ. pestis). Five targeted genes (pagA, capA forB . anthracis and ypo2088, pla, cafA for Y.pestis) showed specificity o f 100% fo r B.cereus chromosomes, except the targeted gene vrrA showed specificityo f 100% for chromosome DNA o f B. anthracis. Keywords: Panel DNA, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, multiplex PCR. ĐẶT VẮN ĐỀ trong chần đoán các tác nhân B. anthracis, Y. pestis. Việc ứng dụng công nghệ sinh học phân tử vào ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ uchẩn đoán mầm bệnh la xu hướng phồ biến hiện nay 1. Chủng v i khuẩn nghiên cứutrên thế giới. Với các vi khuẩn nguy hiểm, nguy cơ Các chủng Bacillus anthracis và Yersina pestiskhủng bố như B. anthracis và Y. pestis việc ứng dụng được iưu giữ tại Học viện Quân y đã được xác định cósinh học phân ìử bằng các kít PCR, multiplex PCR đủ các plasmid chứa các gen độc và chủng vi khuẩntrong chẩn đoán để đáp ứng kịp thời nhu cầu của thực đối chứng (Echerlchia colí7 Bacillus cereus) được đặttiễn là một vấn đề thời sự, quan trọng [2,3]. Một số cơ mua từ cong ty Microbiologies (Mỹ),sở đang nghiên cửu phát triển các bộ kit PCR, Chủng B. anthracis và B. cereus được nuôi cấy vàmultiplex PCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis. Để xác định bằng card api 50CH BioMérieux và thửđảm bảo chất lượng, bộ kít mới phải được kiểm định nghiệm độc ỉực trên động vật (chuột nhắt trắng), sauvới các tiêu chí quan trọng là: độ nhạy, độ đặc hiệu và đỏ sử dụng kỹ thuật nhân gen PCR xác đỉnh mang cácđộ ổn định [4,6]. Mẫu chuẩn dùng trong kiểm định có gen đích VrrẦ trên chromosome, gen độc iực pagA,thể ỉim trong danh mục của WHO hoặc NIBSC capA trên các plasmid pOX1, pOX2Ĩ(National Institute for Biological Standards and Chủng E. coli ATCC 25922 được nuôi cấy và xácControl). Tuy nhiên B. anthracis và Y. pestis đều là vi định bằng card Api 32E BioMérieux. Chùng Y. pesíiskhuẩn nguy hiểm và không có sẵn nên nhóm nghiên được nuôi cấy và xác định bằng card GN46 Vitek 2 -cứu phải tiến hành tạo mẫu chuẩn theo hướng dẫn BioMérieux, sau đó sử .dụng kỹ thuật nhân gen PCRcủa WHO và ...