Thiết lập các bộ panel mẫu ADN để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện Bacillus anthracis

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thiết lập các bộ panel mẫu ADN để khảo sát độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi với 3 cặp mồi vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1 xác định B. anthracis.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thiết lập các bộ panel mẫu ADN để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện Bacillus anthracisT¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017THIẾT LẬP CÁC BỘ PANEL MẪU ADN ĐỂ ĐÁNH GIÁ ĐỘ NHẠY,ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆNBACILLUS ANTHRACISNguy n Thái Sơn*; Tr n Danh Kh i**; Đinh Th Thu H ng***TÓM TẮTMục tiêu: thiết lập các bộ panel mẫu ADN để khảo sát độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứngPCR đa mồi với 3 cặp mồi vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1 xác định B. anthracis. Vật liệu vàphương pháp: các bộ panel mẫu ADN được thiết lập theo hướng dẫn của WHO và NIBSC(Viện Quốc gia các mẫu chuẩn sinh học, Anh). Các bộ mẫu chuẩn ADN được tạo ra là panelngưỡng phát hiện, panel độ nhạy (sử dụng plasmid tái tổ hợp chứa các gen đích đặc trưng vàgen độc lực vrrA, pagA, capA chủng B. anthracis Ba1) và panel đặc hiệu (sử dụng ADN chủngchuẩn Bacillus cereus Bc1). Kết quả và kết luận: ngưỡng phát hiện của phản ứng là 5 x 101copies/phản ứng cùng độ nhạy, độ đặc hiệu đạt 100%. Đây là cơ sở cho các thử nghiệm trênmẫu thực địa.*Từ khóa: Vi khuẩn than; Bộ mẫu chuẩn; PCR đa mồi; Độ đặc hiệu; Độ nhạy.Establishment the In-House DNA Panels for Validation of MultiplexPCR Assay in Detecting Bacillus AnthracisSummaryObjectives: To analyze the sensitivity and specificity of multiplex PCR assay that includesthree primer pairs vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1 for B. anthracis identification on the inhouse DNA panels. Materials and methods: Since there is no international or national referencestandard (panels) for calibration of the anthrax PCR kit, in-house reference standards werecreated according to WHO and NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control)guidelines. The in-house DNA standards consist of sensitivity panel (using recombinant plasmidscontaining the full-length sequence of target vrrA gene in bacterial chromosome, pagA andcapA genes on the virulence plasmid pXO1 and pXO2, respectively) of B. anthracis strain Ba1and a specificity panel (using DNA genome of Bacillus cereus strain Bc1). Results and conclusion:The detection limit of this multiplex PCR is 50 copies per reaction, the sensitivity and specificityare 100% on the in-house reference panels. This is a basis for validation of mPCR assay onenvironment and clinical samples.* Key words: Bacillus anthracis; Panel; Multiplex PCR; Specificity; Sensitivity.* Bệnh viện Quân y 103** Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương*** Học viện Quân yNg i ph n h i (Corresponding): Đinh Th Thu H ng (hangdinhbio@gmail.com)Ngày nh n bài: 07/10/2016; Ngày ph n bi n đánh giá bài báo: 13/12/2016Ngày bài báo đc đăng: 26/12/201613T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2017ĐẶT VẤN ĐỀBacillus anthracis là loài vi khuẩn sinhbào tử gây bệnh than được tìm thấy ởnhiều quốc gia trên khắp thế giới và là ưutiên lựa chọn làm vũ khí sinh học của mộtsố tổ chức khủng bố [8]. Trong một vụ tấncông nghi ngờ có vũ khí sinh học haymẫu môi trường có nguy cơ tiềm ẩn B.anthracis, việc phát hiện nhanh và chínhxác để kết luận có hay không có B.anthracis rất quan trọng. Kỹ thuật PCR đamồi (multiplex PCR - mPCR) với 3 cặpmồi là chỉ thị phân tử loài vrrA (trênchromosome) và sự có mặt của các genđộc lực pagA (trên plasmid pXO1), capA(trên plasmid pXO2) đã được nhómnghiên cứu thiết kế phát hiện chính xác B.anthracis gây bệnh [1]. Mặt khác, để ứngphó hiệu quả với một cuộc tấn công bằngvũ khí sinh học, cần phát hiện tác nhân vikhuẩn than với độ nhạy, độ đặc hiệu caotrong các mẫu phức tạp. Như vậy, để kítPCR đa mồi được đưa vào sử dụng trongchẩn đoán lâm sàng, điều kiện tiên quyếtlà phải được thử nghiệm trên các bộ mẫuchuẩn (panel) với những tiêu chí quantrọng nhất là độ nhạy và độ đặc hiệu [7].Các bộ mẫu chuẩn quốc tế dùng trongkiểm định sinh phẩm chẩn đoán phân tửcó thể tìm trong danh mục của WHO vàNIBSC (Viện Quốc gia các mẫu chuẩnsinh học) [6]. Tuy nhiên, panel mẫu chocác đối tượng vi sinh vật hiện nay vẫncòn hạn chế. B. anthracis là loài vi khuẩnđặc biệt nguy hiểm, vẫn chưa có panelmẫu quốc tế cũng như quốc gia dùng chokiểm định kít chẩn đoán. Do đó, trongcông trình này, nhóm nghiên cứu đã chế14tạo các bộ panel mẫu nội bộ theo hướngdẫn của WHO và NIBSC để đánh giá độnhạy, độ đặc hiệu của phản ứng mPCR,làm tiền đề cho những thử nghiệm lâmsàng và phát triển kít mPCR chẩn đoánvi khuẩn than ở Việt Nam.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Vật liệu nghiên cứu.* Vector: các plasmid tái tổ hợp pJET1.2pagA, pJET1.2-capA và pJET1.2-vrrA chứatoàn bộ gen pagA (thuộc plasmid độc lựcpXO1), capA (thuộc plasmid độc lực pXO2)và vrrA (thuộc chromosome) chủngB. anthacis Ba1 (chủng vi khuẩn than đầyđủ độc lực) đã được thiết lập trong nghiêncứu trước đây của nhóm tác giả [2].* Chủng vi khuẩn: chủng Bacillus cereusBc1 đặt mua từ Hãng Microbiologics (Mỹ)được sử dụng để kiểm tra phản ứng chéovới B. anthacis trong phản ứng mPCR.2. Phương pháp nghiên cứu.* Tách chiết ADN và mPCR: ...