Thiết kế và tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR chẩn đồng thời vi khuẩn than và vi khuẩn dịch hạch

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thiết kế và tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR sử dụng 6 cặp mồi khuếch đại gen đích VrrA, pagA, capA và ypo2088, pla, caf1 chẩn đoán đồng thời B. anthracis và Y. pestis trên các chủng đã xác định có đầy đủ plasmid độc. Đây là cơ sở cho việc chế tạo kit multiplex PCR chẩn đoán đồng thời B. anthracis và Y. pestis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và môi trường.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thiết kế và tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR chẩn đồng thời vi khuẩn than và vi khuẩn dịch hạchTẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015THIẾT KẾ VÀ TỐI U HÓA PHẢN ỨNG MULTIPLEX PCRCHẨN ĐOÁN ĐỒNG THỜI VI KHUẨN THAN VÀVI KHUẨN DỊCH HẠCHNguyễn Văn An*; Nguyễn Thái Sơn*; inh Th Thung**TÓM TẮTMục tiêu: thiết kế và tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR sử dụng 6 cặp mồi khuếch đại genđích VrrA, pagA, capA và ypo2088, pla, caf1 chẩn đoán đồng thời B. anthracis và Y. pestis trêncác chủng đã xác định có đầy đủ plasmid độc. Đây là cơ sở cho việc chế tạo kit multiplex PCRchẩn đoán đồng thời B. anthracis và Y. pestis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và môi trường. Vậtliệu và phương pháp: chủng vi khuÈn (VK) than và dịch hạch lưu giữ tại Học viện Quân y đượcxác định là có đủ các plasmid chứa gen độc của hai VK. Các cặp mồi sử dụng để phát hiện genVrrA, capA, pagA của B. anthracis và gen ypo 2088, pla, caf1 của Y. pestis được thiết kế dựatrên trình tự gen đã công bố trên Ngân hàng Gen. Chủng VK sau khi bất hoạt bằng nhiệt, tiếnhành tách chiết theo thường quy của bộ kit QIAamp ADN mini kit (QIAGEN, Đức). Tối ưu hóaphản ứng multiplex PCR để đảm bảo phát hiện đồng thời các gen đích quan tâm bằng cáchtối ưu hóa thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng. Kết quả và kết luận: thiết kế và tối ưuhóa thành công phản ứng multiplex PCR chẩn đoán đồng thời VK than và dịch hạch, sử dụng6 cặp mồi được thiết kế để khuếch đại 6 gen đích của 2 VK, trong đó 2 gen trên chromosom(VrrA, ypo2088) và 4 gen trên plasmid (capA, pagA, pla, caf1).* Từ khóa: Vi khuẩn than; Vi khuẩn dịch hạch; Multiplex PCR.Establishing a Novel Multiplex PCR to Simultaneously Detect BacillusAnthracis and Yersinia PestisSummaryObjective: The study aimed to establish a novel multiplex PCR by using six new specificprimer pairs targeting to the VrrA, pagA, capA and ypo2088, pla, caf1 genes of B. anthracis andY. pestis. The assay then was used to develop a multiplex PCR kit for simultaneously detectingB. anthracis and Y. pestis which carried toxic plasmid genes from clinical and environmentsamples. Material and method: B. anthracis and Y. pestis strains determined to carry plasmidtoxic genes were used. Six specific primer pairs were designed by using Prime3 software basing onreference sequences retrieved from GenBank. After heat inactivation, DNA from bacteria wasextracted by QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany) following the manufacturer’s instructions.The PCR components and temperature cycle were optimized to ensure the simultaneous detectionof target genes. Findings and conclusion: We succeeded to establish a novel multiplex PCRsimultaneously detecting B. anthracis and Y. pestis. Six specific primer pairs were able toamplify target genes of two bacteria including two chromosome genes (VrrA, ypo2088) and fourplasmid genes (capA, pagA, pla, caf1).* Key words: Bacillus anthracis; Yersinia pestis; Multiplex PCR.* Bệnh viện Quân y 103** Häc viÖn Qu©n yNgười phản hồi (Corresponding): NguyÔn Văn An (ank59hvqy@gmail.com)Ngày nhận bài: 25/02/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2015Ngày bài báo được đăng: 02/04/201567TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015ĐẶT VẤN ĐỀKhủng bố sinh học là mối lo ngại hàngđầu của an ninh thế giới, đặc biệt từ sauvụ khủng bố bằng VK than (Bacillusanthracis) tại Mỹ năm 2001, tiếp theo làviệc xác định được VK dịch hạch (Yersinapestis) trên hai người tại Mỹ năm 2002[5, 9]. Trong một vụ tấn công nghi ngờ cókhủng bố sinh học, việc phát hiện nhanhtác nhân sinh học là một trong những yếutố quyết định đến an ninh quốc gia. Việcsàng lọc nhanh những mẫu nghi ngờ,giúp kiểm soát sự lây lan và đảm bảođiều trị chính xác mầm bệnh. Hiện nay,trong những phương pháp chẩn đoán B.anthracis và Y. pestis, PCR (polymerasechain reaction) là phương pháp có độnhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian chokết quả nhanh [6, 7]. Các nghiên cứu ởtrong nước trước đây chủ yếu tập trungthiết kế phản ứng PCR chẩn đoán từngloại VK than hoặc VK dịch hạch [1, 2, 3],điều này đẫn đến mất nhiều thời gian vàchi phí mới có thể xác định được mầmbệnh vì phải tiến hành nhiều phản ứngPCR. Xuất phát từ những vấn đề trên,chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm:Thiết kế và tối ưu hóa phản ứng multiplexPCR chẩn đoán nhanh, chính xác đồngthời cả hai VK than và dịch hạch.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨUVứ* Chủng VK nghiên cứu: các chủng VKBacillus anthracis và Yersina pestis lưu giữtại Học viện Quân y được xác định có đủcác plasmid chứa gen độc và chủng VKđối chứng (Echerichia coli, Bacillus cereus)đặt mua tại Công ty Microbiologics (Mỹ).* Các cặp mồi: cặp mồi sử dụng đểphát hiện các gen VrrA, capA, pagA củaB. anthracis và gen ypo 2088, pla, caf1của Y. pestis thiết kế dựa trên trình tựgen được công bố trên Ngân hàng Gen,các cặp mồi có trình tự như sau:Bảng 1: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.GENĐÍCHVỊ TRÍ GENMỒITRÌNH TỰSẢN PHẨM(BP)VrrAChromosom VK thanFR5’ CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA 3’5’ CCTCGCGCACTTCTTTTTCT 3’222pagAPlasmid pOX1 VK thanFR5’ AAATGGAGCACGGCTTCTGA 3’5’ AGCCTGTATCCACCCTCACT 3’751capAPlasmid pOX2 VK thanFR5’ TGACGATGACGATGGTTGGT 3’5’ GCTTCCTGTCTAGGACTCGG 3’610ypo2088Chromosom VK dịch hạchFR5’ GGATGAGATAACGCGGGTGT 3’5’ AGAGAATCGTGATGCCGTCC 3’103plaPlasmid pPCP1 VK dịch hạchFR5’ CGGGATGCTGAGTGGAAAGT 3’5’ ATTACCCGCACTCCTTTCGG 3’438caf1Plasmid pMT1VK dịch hạchFR5’ CGCTTACTCTTGGCGGCTAT 3’5’ GCTGCAAGTTTACCGCCTTT 3’27168TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-20152 P ươp ápứu.* Tách chiết ADN:VK B. anthracis và Y. pestis thu hoạchtrong nước muối sinh lý, nồng độ VK đạt106 VK/ml. Tiến hành bất hoạt VK bằngnhiệt ướt ở 1210C x 15 phút để đảm bảotất cả thể dinh dưỡng và bào tử (đối vớiB. anthracis) đều bị tiêu diệt [8]. Sau đó,tách chiết theo thường quy dung dịchcanh khuẩn của bộ kít QIAamp ADN minikit (QIAGEN, Đức). Thực hiện toàn bộquy trình này tr ...