XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN DỊCH HẠCH (YERSINIA PESTIS) TỪ MẪU ĐẤT VÀ NƯỚC NHIỄM KHUẨN

Vi khuẩn dịch hạch (Yersinia Pestis) gây bệnhnguy hiểm cho người và động vật, phân bố khắpthế giới kể cả Việt Nam. Vùng Tây Nguyên vàDuyên Hải miền Trung Việt Nam, cho đến nay, vẫncó nhiều trường hợp bị dịch hạch, do vậy, loại vikhuẩn nguy hiểm này vẫn là mối đe doạ sức khoẻcộng đồng [3,4]. Dịch hạch do bọ chét và loài gặmnhấm làm môi giới truyền lây gây bệnh, và tồn tạilưu cữu trong đất và nước, tạo nên nguồn lây sangngười. Có 3 loại plasmid mà vi khuẩn này sở hữubao gồm, plasmid CD1 (chung với...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN DỊCH HẠCH (YERSINIA PESTIS) TỪ MẪU ĐẤT VÀ NƯỚC NHIỄM KHUẨN TCNCYH 38 (5) - 2005 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN DỊCH HẠCH (YERSINIA PESTIS) TỪ MẪU ĐẤT VÀ NƯỚC NHIỄM KHUẨN Lê Thanh Hoà1, Nguyễn Thị Bích Nga1, Nguyễn Thị Ngọc Dao1, Đỗ Ngọc Khuê 2 1 Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) 2 Phân Viện Công nghệ mới và Bảo vệ Môi trường (Trung tâm KHKT - CNQS), Bộ Quốc Phòng Bệnh dịch hạch là một loại bệnh truyền nhiễm cấp tính. Vi khuẩn dịch hạch có thể chọn làm tác nhânkhủng bố sinh học. Chẩn đoán nhanh vi khuẩn này từ đất nước là cần thiết. Vi khuẩn dịch hạch chứa 3 loạiPlasmid đặc hiệu tạo nên các yếu tố độc lực gây bệnh. Mục tiêu: (1) Xác định độ nhạy và chính xác củaphản ứng PCR chẩn đoán vi khuẩn dịch hạch. (2) Thực hiện phản ứng PCR với nguồn khuôn là ADN tổngsố, ADN của plasmid pPCP1 và vi khuẩn nguyên vẹn với độ pha loãng khác nhau (3) Giả nghiệm vi khuẩntrong mẫu đất - nước và thực hiện chẩn đoán nhanh bằng PCR. Đối tượng và phương pháp: Vi khuẩndịch hạch đã vô hoạt. ADN tổng số bao gồm ADN của vi khuẩn dịch hạch được tách bằng DNeasy Kit, dùngcặp mồi PLAF - PLAR (bám trên gen pla) để nhân đoạn gen pla có độ dài 480bp. Sau khi xác định độ nhạycủa phản ứng PCR, để thực hiện mục tiêu xây dựng Kit chẩn đoán nhanh Y. Pestis, vi khuẩn được hoàtrong mẫu đất và nước theo phương pháp giả nghiệm để kiểm nghiệm phản ứng PCR nhằm xây dựng kitphát hiện phân tử. Kết quả: Với ADN tổng số pha loãng, phản ứng PCR thực hiện thành công ở hàm lượng0,6ng, tương đương với 1 vi khuẩn Y. Pestis. Với vi khuẩn nguyên vẹn (không cần tách ADN tổng số), vớilượng vi khuẩn pha loãng ở nồng độ từ 101 đến 102 (khoảng 100 - 10 vi khuẩn) vẫn cho PCR đặc hiệu. Vớiphương pháp giả nghiệm hoà vi khuẩn vào trong mẫu đất, nước, PCR đặc hiệu vẫn thực hiện thành công ởđộ pha loãng khoảng 1 ng ADN và 4 vi khuẩn làm khuôn. Kết luận: Như vậy, bước đầu Kit chẩn đoánphân tử vi khuẩn dịch hạch đã thử nghiệm thành công từ các loại mẫu, kể cả từ đất, nước sử dụng chỉ thịgen pla của Plasmid pPCP1. Từ khoá: dịch hạch, Yersinia pestis, plasmid pPCP1, gen pla, PCR, giả nghiệm.I. ĐẶT VẤN ĐỀ coi là tin tưởng nhất [2,7]. Y. pestis phân lập ở Việt Nam đã được chính thức giám định, sử dụng Vi khuẩn dịch hạch (Yersinia Pestis) gây bệnh gen pla, giải trình và phân tích trình tự của gennguy hiểm cho người và động vật, phân bố khắp này và đăng ký Ngân hàng Gen số AY305870 [2].thế giới kể cả Việt Nam. Vùng Tây Nguyên và Plasmid độc lực pPCP1 của vi khuẩn dịch hạch ViệtDuyên Hải miền Trung Việt Nam, cho đến nay, vẫn Nam có mức độ bảo tồn tuyệt đối về thành phầncó nhiều trường hợp bị dịch hạch, do vậy, loại vi nucleotit của hệ gen, ít nhất là qua so sánh 480khuẩn nguy hiểm này vẫn là mối đe doạ sức khoẻ nucleotit của phân đoạn gen pla, với các chủngcộng đồng [3,4]. Dịch hạch do bọ chét và loài gặm KIM5; CO92 [8,9] và một số chủng của Ấn Độ, thểnhấm làm môi giới truyền lây gây bệnh, và tồn tại hiện tính gây bệnh thống nhất toàn cầu của loài vilưu cữu trong đất và nước, tạo nên nguồn lây sang khuẩn này [2]. Mục tiêu:người. Có 3 loại plasmid mà vi khuẩn này sở hữu 1. Xác định độ nhạy và chính xác củabao gồm, plasmid CD1 (chung với Y. phản ứng PCR chẩn đoán vi khuẩn dịch hạch.pseudotuberculosis và Y. enterocolitica); plasmidMT1 và pPCP1 (là 2 loại riêng của Y. Pestis) [1]. 2. Thực hiện phản ứng PCR với nguồnChẩn đoán nhanh vi khuẩn dịch hạch không có gì khuôn là ADN tổng số, ADN của plasmidkhác là dựa vào phản ứng PCR, sử dụng các gen pPCP1 và vi khuẩn nguyên vẹn với độ phađộc lực của các loại plasmid này làm chỉ thị di loãng khác nhau.truyền phân tử, trong đó gen pla của pPCP1 được 1TCNCYH 38 (5) - 2005 3. Giả nghiệm vi khuẩn trong mẫu đất - trong 10 phút. Với mồi xuôi là PLAFnước và thực hiện chẩn đoán nhanh bằng (5ATCTTACTTTCCGTGAGAAG3) và mồi ngược làPCR. PLAR (5’ CTTGGATG ...