Phản ứng Multiplex PCR: Các thông số quyết định và quy trình từng bước

Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phảnứng PCR thông thường, ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhânlên đồng thời trong cùng một phản ứng. Từ các mô tả đầu tiênvề nó năm 1988 [6], phương pháp này đã từng được áp dụngthành công trong rất nhiều lĩnh vực thí nghiệm ADN gồm cóphân tích mất đoạn [2,8], đột biến [14], đa hình [11] hoặc trongcác phương pháp định lượng [10] và kỹ thuật PCR sao chépngược (RT-PCR) [7]....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phản ứng Multiplex PCR: Các thông số quyết định và quy trình từng bước Phản ứng Multiplex PCR: Các thông số quyết định và quy trình từng bước O.Henegarui, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance và P.H. Vogt1 Trường Đại học Indiana (Indianapolis, IN, USA) và Trường Đại học Haeidelberg (Heidelberg, Đức) 1 Tạp chí BioTechniques 23: 504-511 (tháng 9/1997) Người dịch: Lưu Quang Minh 1- Giới thiệu Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng. Từ các mô tả đầu tiên về nó năm 1988 [6], phương pháp này đã từng được áp dụng thành công trong rất nhiều lĩnh vực thí nghiệm ADN gồm có phân tích mất đoạn [2,8], đột biến [14], đa hình [11] hoặc trong các phương pháp định lượng [10] và kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR) [7]. Vai trò của các thành phần hoá chất khác nhau trong phản ứng PCR đã từng được đề cậpđến [3, 9, 12, 13], và quy trình phản ứng multiplex PCR cũng đã được miêu tả bởi rất nhiềunhóm nghiên cứu khác nhau. Tuy nhiên, rất ít công trình nghiên cứu [5, 15] đưa ra thảo luận rộngrãi về một số nhân tố (ví dụ: nồng độ mồi, chu trình nhiệt) có thể ảnh hưởng tới kết quả củaviệc phân tích phản ứng multiplex. Trong nghiên cứu này, hơn 50 locus đã được nhân lên trongnhiều phản ứng multiplex PCR khác nhau sử dụng một loại đệm PCR chứa KCl thông thường.Một nghiên cứu về các thông số ảnh hưởng tới việc khuếch đại trong phản ứng multiplex PCRđã được tiến hành nhằm giải quyết một số vần đề đặc biệt trong phản ứng multiplex PCR baogồm cả việc các locus được nhân lên một cách thất thường hoặc không được nhân lên và nhữngkhó khăn trong việc đưa ra kết luận. Căn cứ vào kết quả nghiên cứu này, một quy trình từngbước cho phản ứng multiplex PCR đã được thiết kế (hình 1) với các giải pháp thực tiễn chonhiều vấn đề vướng mắc. Quy trình này sẽ rất có ích cho những công việc sử dụng công nghệPCR trên cả hai lĩnh vực nghiên cứu và điều trị.2- Nguyên liệu và phương pháp2.1- Những dung dịch và hoá chất cần thiết cho phản ứng PCR Nucleotide (dNTP) (hãng Pharmacia Biotech [Piscataway, NJ, USA] hoặc hãng BoehringerMannheim [Indianapolis, IN, USA]) được bảo quản dưới dạng dung dịch gốc 100mM (25mMmỗi loại dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Đệm PCR 10x chuẩn của hãng Perkin-Elmer, Norwalk, CT,USA bao gồm: 200mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 8.3 (ở 240C) và 15mM MgCl2. Taq ADNPolymerase được mua từ hãng Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) hoặc từ hãng Perkin-Elmer. Dimethyl sulfoxide (DMSO), albumin huyết thanh bò (BSA) và glycerol được mua từ hãngSigma Chemical (St. Louis, MO, USA). Mồi được lấy từ hãng Genosys [The Woodlands, TX,USA] hoặc Research Genetics [Huntsville, AL, USA] hoặc được tự tổng hợp và được sử dụngtrong phản ứng với nồng độ cuối cùng từ 10 đến 25 pmol/uL mỗi mồi. Một nhóm các cặp mồi(sY) được sử dụng để chỉ ra sự mất đoạn trên nhiễm sắc thể giới tính Y [8, 16]. 15 cặp mồikhác được sử dụng đối với gen trên nhiễm sắc thể giới tính X của người gây nên bệnh teo cơDuchenne (Duchenne muscular dystrophy - DMD) [4].Các cặp mồi khác chỉ ra sự đa hình của các locus (microsatellites) trên nhiễm sắc thể số 12 ởngười (Research Genetics). Các cặp mồi trên được đưa vào trong các hỗn hợp phản ứngmultiplex như đã miêu tả ở bảng 1 và các hình 2b, 3b, 5e. ADN hệ gen được tách chiết và tinhsạch theo quy trình sử dụng Sodium dodecyl sulfate (SDS)/proteinase K (hãng BoehringerMannheim).2.2- Quy trình PCR cơ bản Phản ứng PCR cơ bản (thể tích 25µ L) bao gồm: nước khử ion hấp khử trùng; đệm PCR(1x); hỗn hợp dNTP (200µ M mỗi loại); các mồi (0.04-0.6µ M mỗi loại); DMSO, glycerol hoặcBSA (5%-nếu dùng); Taq ADN polymerase (1-2 U/25µ L phản ứng) và ADN hệ gen (150ng/25µ Lphản ứng). Các thành phần phản ứng có thể cho vào theo các thứ tự khác nhau nhưng nên đưanước vào trước tiên. Việc trộn mẫu phải được thực hiện trên đá lạnh, và các tube phản ứngphải được giữ trên đá trước khi đặt chúng vào khuôn kim loại đã được làm nóng hoặc nồi ửwater-bath (940C) của máy chu trình nhiệt (máy PCR). Đối với việc đánh dấu phóng xạ, 1µ Ci[32P]dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) ngay lập tức được đưa vào 100uL hỗn hợpchính trước khi bắt đầu phản ứng. Kết quả phản ứng ...