Nghiên cứu thành phần gen H5 của virus cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên - Huế

Trong bài báo này các tác giả so sánh thành phần gen H5 của một chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên - Huế và phân tích quan hệ phả hệ với các chủng khác của Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu thành phần gen H5 của virus cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên - Huế TAP CHI KHOA HOC, Đai hoc Huê, Sô 46, 2008 ̣ ́ ̣ ̣ ̣ ́ ́ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN GEN H5 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1  PHÂN LẬP TỪ VỊT TẠI THỪA THIÊN ­ HUẾ Trần Quang Vui Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế Lê Thanh Hoà Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam TÓM TẮT              Phân đoạn gen HA(H5) của một chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ  vịt tại Thừa   Thiên ­ Huế (ký hiệu A/Dk/Vietnam/Hue/2004) đã được thu nhận bằng phương pháp RT­PCR,   dòng hoá, giải trình trình tự, so sánh thành phần gen và phân tích quan hệ phả hệ. Gen H5 của   chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 (Thừa Thiên­Huế) có tỷ lệ tương đồng cao so với các chủng từ   các vùng miền khác của Việt Nam (Hậu Giang, Tiền Giang và Cà Mau) và có thể cùng nguồn   gốc dòng Quảng Đông với các chủng cúm A/H5N1 này. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của mọi   loài chim, kể cả gia cầm và thủy cầm, do các phân týp (subtype) của nhóm virus cúm A  (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. H5N1 là một phân týp có độc lực cao, xuất hiện gần đây tại các nước châu Á,   châu Âu, châu Phi và được chứng minh là có khả  năng lây nhiễm từ  động vật sang   người và gây bệnh trên người trong các vụ  dịch cúm gia cầm những năm 1996­2008.  Ở  Việt Nam, những vụ dịch cúm gia cầm do H5N1 đã xảy ra trên toàn bộ  đất nước,   hàng triệu gia cầm bị chết và bị tiêu huỷ, gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế quốc dân.  Virus cúm A chứa hệ gen ARN một sợi âm bao gồm 8 phân đoạn (PB2, PB1,   PA, HA, NP, NA, MA, NS), trong đó phân đoạn 4 mã hoá cho protein hemagglutinin   (HA) là một protein thụ thể có vai trò bám dính vào tế bào chủ và là kháng nguyên bề  mặt chịu trách nhiệm độc lực trong cơ chế gây bệnh của virus. Virus cúm gia cầm có  khả năng tái tổ hợp biến chủng để thích nghi và rất dễ thay đổi cấu trúc kháng nguyên   (Lê Thanh Hòa và cs, 2004). Hiện nay, các phương pháp sinh học phân tử đã được sử  dụng để thu nhận một phần hoặc toàn bộ  gen H5N1, xác định đặc tính sinh học phân  tử, định loại subtype, giải trình trình tự, so sánh phân tích số liệu và xem xét di truyền  quần thể, tiến hóa nguồn gốc của các biến chủng H5N1 (Wan và cs, 2005; Lê Thanh  Hòa, 2006).  Trong bài báo này chúng tôi so sánh thành phần gen H5 của một chủng virus   cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên ­ Huế và phân tích quan hệ phả hệ với các   chủng khác của Việt Nam. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Bệnh phẩm là dịch khí quản­phế quản chứa virus cường độc cúm A/H5N1 thu   thập từ vịt tại Thừa Thiên ­ Huế năm 2004 (A/Dk/Vietnam/Hue/2004) đã được vô hoạt   bằng nhiệt độ, bảo quản ở ­20oC. Các loại sinh phẩm đã được sử dụng trong nghiên cứu: i) Bộ kit QIAamp Viral   Mini kit (QIAGEN Inc.) tách chiết ARN hệ gen của virus; ii) Bộ kit One­step RT­PCR   của hãng Invitrogen thực hiện phản ứng RT­PCR; iii) Bộ kit QIAquick Purification kit   (QIAGEN Inc.); iv) Bộ kit TOPO­TA cloning (Invitrogen) dùng dòng hóa sản phẩm; v)  Chủng vi khuẩn E. coli DHα­T1; vi) Bộ kit QIApreps Spin Miniprep (QIAGEN Inc.) sử  dụng tách ADN của các plasmid tái tổ  hợp; vii) Bộ  kit DyeEx 2.0 Spin Kit (QIAGEN   Inc.) dùng tinh sạch phản ứng giải trình tự. Tách ARN hệ gen của virus ARN hệ  gen của virus  được tách chiết bằng bộ  kit QIAamp Viral Mini kit  (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng RT­PCR Cặp mồi dùng cho phản ứng RT­PCR thu nhận toàn bộ gen H5: Mồi xuôi H5BAMF: 5'CGGGATCCTCTGTCAAAATGGAGAAAATAGTGCTT3', tương  ứng vị  trí  19­34 trong phân đoạn 4, có bố  trí điểm cắt của enzyme giới hạn BamHI (gạch bên  dưới). Mồi ngược H5NOTR: 5'ATAAGAATGCGGCCGCTCATTAAATGCAAATTCTGCATTGTAACGA3',  tương ứng vị trí 1708­1735 trong phân đoạn 4, có bố trí điểm cắt của enzyme giới hạn   NotI (gạch bên dưới). Toàn bộ  phân đoạn HA của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 có độ  dài khoảng  1700 bp được thu nhận bằng phản  ứng RT­PCR một bước với cặp mồi H5BAMF ­   H5NOTR, theo chu trình nhiệt như sau: 50oC/60 phút, 95oC/15 phút, 35 chu kỳ [94oC/1  phút, 55oC/30 giây, 72oC/2 phút], 72oC/10 phút, sau chu kỳ  cuối cùng bảo quản sản   phẩm ở 4oC cho đến khi kiểm tra và tinh sạch sản phẩm. Kiểm tra sản phẩm RT­PCR, tinh sạch và dòng hóa sản phẩm vào vector  tách dòng Sản phẩm RT­PCR được kiểm tra trên agarose 1%, được tinh sạch bằng bộ kit  QIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn. Gen HA trong s ản ph ẩm sau   khi tinh sạch được dòng hóa vào vector pCR2.1TOPO (Invitrogen). Các phản  ứng nối  ghép gen, chuyển nạp plasmid vào tế  bào  E. coli  bằng phương pháp tạo sốc nhiệt  được tiến hành theo đúng quy trình. Vi khuẩn tái tổ hợp được chọn lọc nuôi cấy trong   môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút  ở  37oC trong 16­20 giờ. Tế  bào được thu lại  bằng ly tâm và tách chiết ADN plasmid bằng bộ kit QIApreps Spin Mini kit của hãng   QIAGEN. Giải trình trình tự và phân tích số liệu   Trình tự  nucleotide ADN của plasmid được giải trình trên máy tự  động ABI­ 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) có tại Viện Công nghệ  Sinh học.   Chuỗi nucleotide được xử  lý bằng chương trình SeqEd1.03, sau đó sử  dụng chương   trình AssemLIGN 1.9 và hệ  chương trình MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính  Macintosh. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu các chuỗi bằng chương trình GENEDOC  2.5.  Chọn chuỗi so sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide Chuỗi nucleoti ...