Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh vi-rút gây bệnh khảm vàng (PYMoV) trên cây hồ tiêu ở Việt Nam

Bài viết sử dụng cùng lúc 4 cặp mồi, trong 4 tube PCR riêng biệt, được thiết kế tại các vùng gene bảo thủ tương ứng trên 4 ORFs (OFR1 - OFR4) của bộ gene PYMoV trong cùng 1 phản ứng PCR với yêu cầu cả 4 cặp mồi đều cho kết quả dương tính rõ trên DNA của mỗi mẫu nhi m bệnh và đều âm tính trên mẫu đối chứng khỏe. Các cặp mồi này chỉ được đề xuất sử dụng khi chúng đều cho kết quả tương tự trong phản ứng RT-PCR, ở bước tiếp theo, sử dụng RNA tổng số tách chiết từ cùng 1 mẫu giám định.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh vi-rút gây bệnh khảm vàng (PYMoV) trên cây hồ tiêu ở Việt Nam BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN NHANH VI-RÖT GÂY BỆNH KHẢM VÀNG (PYMoV) TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở VIỆT NAM Study on PCR Techniques for Detection of Piper Yellow Mottle Virus (PYMoV) on Black Pepper in Viet Nam 1 1 1 Tạ Hoàng Anh , Nguyễn Hồng Tuyên , Nguyễn Thúy Hạnh , 1 2 Nguyễn Thị Thúy và A Ishwara Bhat . Ngày nhận bài: 25.09.2018 Ngày chấp nhận: 28.09.2018 Abstract Four pairs of primers designed at conserved regions corresponding to four Open Reading Frames - OFR1, OFR2, OFR3 and OFR4, of the Piper yellow mottle virus (PYMoV) genome were used in four separated tubes in the same polymerase chain reaction (PCR) for each sample after extraction of total DNA using CTAB method. All four primer pairs gave bright and a single band of expected size including 379bp, 352bp, 539bp and 420bp, respectively, only on the lanes of infected sample but not any in the lane of healthy plant sample (as negative control) on a 0.8% agarose gel after electrophoresis. Like many other Budnavirus, PYMoV was found to occur endogenous virus intergrated most of their genomic sequence in the sequence of the host plant. Hence, in this study for the confirmation of any unspecific amplification in PCR (though no band was found on the healthy control DNA after PCR), the One-Step RT-PCR was done using the same pairs of primers after total RNA extraction using Tri-Reagent. The same result was obtained after electrophoresis as done previously by PCR. Afterwards, the serial dilution of DNA extract was done and gave the sensitivity of PCR protocol was -3 of 10 . These results of PCR and RT-PCR helped to recommend a good protocol using either one of or all those four pairs of primers for a specific and sensitive detection of PYMoV from infected black pepper plants in Vietnam by PCR. Keywords: Piper yellow mottle virus, detection, PCR, RT-PCR * 1. ĐẶT VẤN ĐỀ biến ở hầu khắp các vườn trồng tiêu trên thế giới, nhất là ở các khu vực có vĩ độ cao, năng Cây hồ tiêu (Piper nigrum L., Piperaceae) là suất và chất lượng hạt tiêu giảm đáng kể, cây lụi một cây gia vị quan trọng, đem lại giá trị kinh tế dần và chết (Bhat et al., 2003, 2005). Những cao và được trồng phổ biến ở nhiều nước Đông triệu chứng này đã được xác định là do vi-rút Nam Á, trong đó có Việt Nam. Theo thống kê của khảm vàng hồ tiêu, tên tiếng Anh là Piper yellow Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, tính đến năm 2015, mottle virus (PYMoV), thuộc nhóm Badnavirus, tổng diện tích trồng hồ tiêu cả nước lên đến họ Caulimoviridae, và đã được ghi nhận ở các 101.623 ha, tập trung chủ yếu ở miền Đông Nam nước Braxin, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Sri Bộ và Tây Nguyên, chiếm 93,50% diện tích trồng Lanka, Thái Lan (Lockhart et al., 1997; Duarte et hồ tiêu trong cả nước. Có 3 giống hồ tiêu được al., 2001; de Silva et al., 2002; Bhat et al., 2003). ưa chuộng và trồng phổ biến hiện nay gồm Tiêu Bên cạnh PYMoV, các nhóm tác giả cũng ghi Vĩnh Linh (Tiêu Sẻ), Tiêu Trâu và Tiêu Ấn Độ. nhận Cucumber mosaic virus (CMV) gây nhi m Diện tích hồ tiêu của Việt Nam năm 2015 đạt trên hồ tiêu nhưng chủ yếu nhi m kép với 176.789 tấn, chiếm 32% sản lượng của thế giới. PYMoV với tần suất xuất hiện thấp đến rất thấp Năng suất hồ tiêu bình quân của nước ta đạt 2,6 (Deeshma and Bhat, 2017). tấn/ha, vùng Tây Nguyên cao nhất đạt 3,1 tấn/ha. Các triệu chứng tương tự như đã được ghi Hiện tượng cây hồ tiêu sinh trưởng kém, độ nhận ở các nước trồng hồ tiêu trên thế giới cũng d ...