Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen định danh nấm đường sinh sản ở phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ (18 - 49 tuổi) đã có chồng tại thị xã Quảng Yên tỉnh Quảng Ninh (2013-2014)

Bài viết tiến hành nghiên cứu trên 398 phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ (18 - 49 tuổi) đã có chồng tại thị xã Quảng Yên, tỉnh QuảngNinh được khám sản khoa và lấy mẫu xét nghiệm dịch âm đạo tìm ký sinh trùng.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen định danh nấm đường sinh sản ở phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ (18 - 49 tuổi) đã có chồng tại thị xã Quảng Yên tỉnh Quảng Ninh (2013-2014)TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN ĐỊNH DANHNẤM ĐƢỜNG SINH SẢN Ở PHỤ NỮ TRONG ĐỘ TUỔI SINH ĐẺ(18 - 49 TUỔI) ĐÃ CÓ CHỒNG TẠI THỊ XÃ QUẢNG YÊNTỈNH QUẢNG NINH (2013 - 2014)Cao Bá Lợi*; Vũ Quyết Thắng* và CSTÓM TẮT398 phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ (18 - 49 tuổi) đã có chồng tại thị xã Quảng Yên, tỉnh QuảngNinh được khám sản khoa và lấy mẫu xét nghiệm dịch âm đạo tìm ký sinh trùng. Kết quả:116 phụ nữ nhiễm Candida sp. bằng phương pháp nuôi cấy trong môi trường Sabouraud,sau đó, những phụ nữ này được xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR với gen mồi ITS1 và ITS4 vàsử dụng enzym phân cắt hạn chế Msp I để định danh loài nấm, kết quả: 95/106 (89,6%) mẫucho kết quả (+).Lựa chọn 95 mẫu tiến hành thôi gel, 51 mẫu cho kết quả 2 băng, tiến hành thôi gel mỗi mộtbăng ADN riêng rẽ và thu từng băng để giải trình tự. Truy cập Ngân hàng Gen và phân tíchgiám định loài 51 chuỗi gen cho thấy: 27 mẫu C. glabrata, 15 mẫu C. albicans, 6 mẫu C. tropical,2 mẫu C. parapsilosis, 1 mẫu C. krusei.* Từ khóa: Nấm đường sinh sản; PCR; Phụ nữ độ tuổi sinh đẻ; Quảng Ninh.Application of PCR and Electrophoresis Gel Sequencing forQuantification of Vaginal Candidiasis in 398 Married Women atReproductive Age (18 - 49) in Quangyen, Quangninh (2013 - 2014)SummaryThe research was conducted in Quangyen, Quangninh provice on 398 married women atreproductive age (18 - 49). Obstetric examination was carried out, vaginal samples were examinedby Gram staining and cultured in Sabouraud medium for yeart gentital tract. The result showedthat 116 samples infected with Candida spp. 106/116 samples were tested using PCR atVietnam Institute of Biotechnology with ITS 1 - ITS4 target gene resulting in 95/106 (89.6%)positive samples.Selection of 51 samples in total of 95 positive samples were subjected to gel purifiel DNAfrom electrophoresis gel sequencing. PCR product made 2 saparated bands, it was purifiedseperately.* Viện Sốt rột - Ký sinh trựng và Côn trùng TWNgười phản hồi (Corresponding): Cao Bá Lợi (saudaihocvsr2008@gmail.com)Ngày nhận bài: 09/10/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/11/2014Ngày bài báo được đăng: 26/11/201459TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014The order of the nucleotide sequence was handled by specialized software, with referencesequence in gene banks. Results: 27 samples were as C. glabrata, 15 samples purified as C.albicans, 6 samples as C. tropical, 2 samples known as C. parapsilosis and and 1 samples asC. krusei.* Key words: Vaginal candidiasis; PCR; Women at reproductive age; Quangninh province.ĐẶT VẤN ĐỀTại Việt Nam, các bệnh nhiễm trùngđường sinh sản (ĐSS) có xu hướng tăngcao do nhiều nguyên nhân như: thói quensinh hoạt mất vệ sinh, nguồn nước bị ônhiễm, tệ mại dâm, tình trạng nạo pháthai không kiểm soát… dẫn đến tình trạngnhiễm trùng ĐSS, đặc biệt nhiễm nấmCandida sp. ĐSS. Vũ Đức Bình và CS(2013) nghiên cứu trên phụ nữ 18 - 49 đãcó chồng tại huyện Tam Nông, Phú Thọbằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gennấm ký sinh ĐSS thấy: tỷ lệ nhiễmCandida sp. ĐSS là 30,5%, trong đó,Candida glabrata (C. glabrata) chiếm 43,5%,Candida tropicalis (C. tropicalis) 34,8%,Candida albicans (C. albicans) 14,6%,Candida krusei (C. krusei) 4,3% và Candidaparapsilosis (C. parapsilosis) 2,8% [1, 2].Tại Quảng Ninh nói chung và thị xãQuảng Yên nói riêng đến nay chưa cócông trình nghiên cứu nào đi sâu và đầyđủ về tình trạng nhiễm nấm ĐSS ở phụnữ trong độ tuổi sinh đẻ, nhưng các yếutố nguy cơ nhiễm nấm ĐSS rất cao. Vớitính cấp thiết của vấn đề và để xác địnhtỷ lệ thành phần loài nấm ĐSS, chúng tôithực hiện nghiên cứu với mục tiêu: Ứngdụng kỹ thuật PCR và giải trình tự genxác định tỷ lệ, thành phần loài nấm ĐSS ởphụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ (18 - 49 tuổi)60đã có chồng tại thị xã Quảng Yên, tỉnhQuảng Ninh.ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Đối tượng, địa điểm và thời giannghiên cứu.- Đối tượng nghiên cứu: phụ nữ trongđộ tuổi sinh đẻ (18 - 49) đã có chồng, tìnhnguyện tham gia nghiên cứu.- Địa điểm nghiên cứu:+ Lấy mẫu bệnh phẩm tại thị xã QuảngYên, tỉnh Quảng Ninh.+ Tiến hành kỹ thuật PCR giải trình tựgen nấm tại Phòng Miễn dịch học, ViệnCông nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoahọc Việt Nam.- Thời gian nghiên cứu từ 4 - 2014 đến10 - 2014.2. Phương pháp nghiên cứu.- Cỡ mẫu nghiên cứu: cỡ mẫu điềutra cắt ngang đánh giá tình trạng nhiễmnấm ĐSS là 384, trong thực tế chúng tôinghiên cứu 398 mẫu.Thực hiện kỹ thuật PCR giải trình tựgen 106/116 mẫu nấm.- Thu thập và bảo quản mẫu [3, 4]:gồm các bệnh phẩm lấy từ dịch âm đạotại cùng đồ sau, sau đó, nuôi cấy trongmôi trường Sabouraud có kháng sinhchloramphenicol, pH = 5,0.TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014Các mẫu bệnh phẩm (+) với nấmCandida spp. mỗi mẫu cho vào túi riêngbiệt và chuyển về Phòng Miễn dịch học,Viện Công nghệ Sinh học. Bảo quản ởngăn mát (4 - 100C) (tủ lạnh thường) đếnkhi tiến hành tách ADN tổng số.- Bổ sung 100 µl NaCl 5 M, 100 µlCTAB/NaCl (4,1 g NaCl; 10 g CTAB;trong 100 ml nước), làm nóng đến 65oC,lắc xoáy đến khi toàn bộ dịch chuyểnsang màu trắng sữa và ủ 65oC trong 10phút.Tiến hành tách ADN tổng số (ADN hỗnhợp của tế bào nấm) theo quy trình sau:- Bổ sung 450 µl hỗn hợp chloroform/isoamyl alcohol 24:1 và lắc xoáy trong 10giây. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.- Dùng que cấy (loop) lấy đầy tế bàonấm từ bề mặt ống nuôi cấy và chuyểnvào ống Eppendorf (dung tích 1,5 ml).- Chuyển dịch nổi sang ống Eppendorfmới, bổ sung 450 µl isopropanol, ủ trongđá 10 phút.- Bổ sung 400 µl đệm TE (500 µl Tris-HClpH 6,8 1 M; 100 µl EDTA, pH8 0,5 M vànước đến tổng số 50 ml). Ủ 800C trong20 phút để giết tế bào nấm, sau đó hạ nhiệtđộ xuống nhiệt độ phòng.- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút;loại bỏ dịch nổi ...