Nghiên cứu ứng dụng protein E2 tái tổ hợp của virut chikungunya phát hiện kháng thể kháng virut chikungunya bằng phương pháp elisa

Nội dung bài viết trình bày về protein vỏ E2 tái tổ hợp của virut Chikunguya (CHIKV) được biểu hiện trên hệ E.coli và ứng dụngtrong phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng CHIKV. Protein tái tổ hợp phát hiện IgG của CHIKV với tỷ lệ 58,6% khi so sánh với phương pháp miễn dịch huỳnh quang trên 29 mẫu dương tính với CHIKV bằng phương pháp ELISA.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu ứng dụng protein E2 tái tổ hợp của virut chikungunya phát hiện kháng thể kháng virut chikungunya bằng phương pháp elisaTẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEIN E2 TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUTCHIKUNGUNYA PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUTCHIKUNGUNYA BẰNG PHƢƠNG PHÁP ELISAVũ Xuân Nghĩa*; Axel Rethwilm**TÓM TẮTProtein vỏ E2 tái tổ hợp của virut Chikunguya (CHIKV) được biểu hiện trên hệ E.coli và ứng dụngtrong phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng CHIKV. Protein tái tổ hợp phát hiện IgG củaCHIKV với tỷ lệ 58,6% khi so sánh với phương pháp miễn dịch huỳnh quang trên 29 mẫu dương tínhvới CHIKV bằng phương pháp ELISA. Kết quả cho thấy, protein vỏ E2 có thể được ứng dụng trongchẩn đoán huyết thanh học.* Từ khóa: CHIKV; Protein tái tổ hợp.APPLICATION OF CHIKUNGUNYA VIRUS E2 RECOMBINANTPROTEIN TO DETECT CHIKUNGUNYA VIRUS IgG BY ELISAsummaryChikungunya virus E2 recombinant protein was expressed in E.coli system and applied in ELISAto detect Chikungunya IgG. The recombinant protein identified CHIKV IgG with 58.6% when comparingwith immunofluorescence assay in 30 positive CHIKV sera by ELISA. The results showed the recombinantprotein could be applied in serology assays.* Key words: CHIKV; The recombinant protein.ĐẶT VẤN ĐỀVirut Chikungunya là Alphavirus, thuộchọ Togaviridea. CHIKV gây ra các vụ dịchsốt xuất huyết với những biểu hiện: sốt cao,phát ban và đau đa khớp [4]. CHIKV truyềnbệnh thông qua vector muỗi Ae. agypti vàAe. albopictus [1, 3]. Genome của CHIKVcó độ lớn khoảng 12 kb, chứa gen mã hóacho protein không cấu trúc và protein cấutrúc. Protein cấu trúc gồm capsid protein vàhai protein vỏ E1, E2 [5]. Protein tái tổ hợpcó nhiều ưu thế và được ứng dụng rộng rãitrong chẩn đoán huyết thanh học. Vì vậy,trong nghiên cứu này, protein tái tổ hợp E2của CHIKV được ứng dụng trong chẩn đoánhuyết thanh học.ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Đối tượng nghiên cứu.- Chứng dương: 29 mẫu huyết tươngchứa IgG của CHIKV, được chuẩn hóabằng phương pháp miễn dịch huỳnh quangtừ Berhard Nocht Institut (BNI), Đại họcHumburg (CHLB Đức).* Học viện Quân y** Đại học Tổng hợp Wuerzburg, CHLB ĐứcChịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Trịnh Thị Xuân HòaPGS. TS. Nguyễn Lĩnh Toàn39TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013- Chứng âm: 100 mẫu huyết tương củangười Đức khỏe mạnh bình thường, từ ViệnVirut-Miễn dịch học, Đại học Wuerzburg(CHLB Đức).- Protein E2 tái tổ hợp được biểu hiện vàtinh sạch trên hệ E.coli.2. Phương pháp nghiên cứu.* Phương pháp biểu hiện và tinh sạchprotein tái tổ hợp E2:Vector pET200/D-recombinant E2 proteinđược biến nạp vào tế bào BL21 star, nuôitế bào trong 50 ml môi trường LB vớikanamycine 50 μg/ml qua đêm ở 370C trênmáy lắc. Ngày hôm sau, pha dung dịch nuôicấy với LB-Kana-medium mới và tiếp tụcnuôi đến giá trị OD600 = 0,6. Để biểu hiệnprotein, cho IPTG vào dung dịch nuôi cấyvới nồng độ cuối 1 mM. Thu vi khuẩn sau4 giờ và phá hủy bằng dung dịch đệm B(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 Murea, pH 8,0). Ly tâm dung dịch tế bàotrong 30 phút, 13.000 rpm trên máy siêu lytâm rotor SS34, loại phần cặn tế bào khônghòa tan. Trộn phần nước nổi chứa proteintái tổ hợp với Ni-NTA-agarose beads theotỷ lệ 1:10. Rửa hỗn dịch với 4 ml dung dịchđệm C (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl,8 M urea, pH 6,3) và tách tinh sạch proteintái tổ hợp bằng 0,5 ml dung dịch đệm D(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 Murea, pH 5,9 ) và dung dịch đệm E (100 mMNaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 4,5).Phân tích protein tái tổ hợp bằng phươngpháp điện di protein SDS-PAGE nhuộmCoomassie blue và Western blot khi sửdụng monoclonal anti-HIS-antibodies.* Phương pháp ELISA gián tiếp đánh giákhả năng phát hiện IgG của protein tái tổhợp E2:Pha loãng protein trong PBSN (phosphatedung dịch đệm saline natriumazid) ở nồngđộ 220 μg/ml. Ủ 50 μl dung dịch protein phaloãng ở mỗi giếng trong đĩa ELISA. Sau đó,phủ kín đĩa bằng tấm plastic và ủ qua đêmở 40C. Ngày hôm sau, bỏ dịch ủ, rửa đĩa 3lần với nước cất không ion. Tiến hành bướcblock bằng ủ với 50 μl blocking dung dịchđệm trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Rửađĩa 2 lần với nước cất không ion. Ủ vớihuyết tương chứng dương và kháng thể khicho 50 μl huyết tương chứng dương vàomỗi giếng (pha loãng huyết tương trongdung dịch blocking dung dịch đệm, tỷ lệ1:100). Che phủ với tấm plastic, ủ ở nhiệtđộ phòng trong 2 giờ. Rửa đĩa 3 lần vớinước cất không ion. Thêm 50 μl kháng thểthứ 2 (IgG), pha loãng ở 1:5.000 trong dungdịch blocking dung dịch đệm. Che phủ đĩavới tấm plastic và ủ ở nhiệt độ phòng trong2 giờ. Rửa đĩa 2 lần với nước cất khôngion. Cho phụ gia và đo kết quả bằng pipet75 μl NPP (p-nitrophenyl phosphate) vàomỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.Sau khi phát triển màu (màu vàng), đọc đĩatrên máy ELISA ở bước sóng 405 nm.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀBÀN LUẬNĐể phát triển phương pháp chẩn đoánhuyết thanh học, protein tái tổ hợp được41TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013biểu hiện và ứng dụng phát hiện kháng thểkháng CHIKV trên bệnh nhân nhiễm CHIKV.1. Kết quả biểu hiện tinh sạch proteinE2 tái tổ hợp của CHIKV.Quá trình tinh sạch thu được các phânđoạn protein tái tổ hợp của CHIKV. Phântích toàn bộ phân đoạn protein tái tổ bằngphương pháp điện di protein SDS-PAGEnhuộm Coomassie blue (hình 1) và Westernblot (hình 2).phân đoạn rửa (cột 3 - 4) và các phân đoạntách protein với dung dịch đệm D (cột 5 - 8);dung dịch đệm E (cột 9 - 12). Cột 1: proteinmarker.Cả hai phương pháp phân tích đều thấy:các protein thu được phù hợp với kíchthước của protein E2 tái tổ hợp. Protein bắtđầu tách ra khỏi hỗn dịch ngay trong phânđoạn khi sử dụng dung dịch đệm D. Khitách với dung dịch đệm E, protein tái tổ hợptách nhiều (cột 9 - 12, hình 2). Trong quátrình tinh sạch với dung dịch đệm E cũngxuất hiện những band không phù hợp (cácprotein của E.coli không đặc hiệu, cột 9 - 12,hình 2). Nhưng ở các phân đoạn tách vớidung ...