Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện kiểu gene VEGF và kiểu đột biến gene EGFR ứng dụng trong điều trị đích ung thư phổi

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết này nhằm xây dựng quy trình xét nghiệm phát hiện kiểu gene VEGF và kiểu đột biến mất đoạn (Del19 (746-750)), đột biến điểm trên Exon21 (L858R) của gene EGFR. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết hơn nội dung nghiên cứu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện kiểu gene VEGF và kiểu đột biến gene EGFR ứng dụng trong điều trị đích ung thư phổi24 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN KIỂU GENE VEGF VÀ KIỂU ĐỘT BIẾN GENE EGFR ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ ĐÍCH UNG THƯ PHỔI Ngô Tất Trung1, Đinh Ngọc Sỹ2, Nguyễn Viết Nhung2, Đặng Văn Khiêm2, Vũ Xuân Phú2, Nguyễn Chi Lăng2, Hàn Trung Điền2, Đào Thanh Quyên1 và Lê Hữu Song1 1 Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 2 Bệnh Viện Phổi Trung ương TÓM TẮT Đặt vấn đề: Tiên lượng hiệu quả điều trị đích UTP phải dựa vào xét nghiệm xác định đột biến gene hoặc kiểu gene đích. Mục tiêu: Xây dựng quy trình xét nghiệm phát hiện kiểu gene VEGF và kiểu đột biến mất đoạn (Del19 (746-750)), đột biến điểm trên Exon21 (L858R) của gene EGFR. Vật liệu và phương pháp: Các dòng tế bào UTPKTBN mang đột biến gene EGFR được nuôi cấy trong các điều kiện chuẩn. Tính đa hình của gen VEGF được xác định bằng phương pháp động học allele đặc hiệu real-time PCR. Đột biến gene EGFR được xác định bằng PCR đa mồi đặc hiệu allele hai hướng tích hợp công nghệ ARMS và kiểm tra lại bằng giải trình tự gene. Ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu của phương pháp được xác định bằng cách pha loãng nồng độ tế bào theo tỷ lệ 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 và 100:100, sau đó tiến hành tách DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. Kết quả: Đã hoàn thiện kỹ thuật động học allele đặc hiệu real-time PCR cho phép phát hiện đồng thời 2 thể đa hình Rs833061 và Rs3025039 của gene VGFR. Công nghệ PCR đặc hiệu hai hướng allele cũng cho phép xác định được đột biến gene EGFR tại exon 19, exon 21 với ngưỡng phát hiện là 0,1%. Độ đặc hiệu kỹ thuật là 100%. Giải trình tự gene đã khẳng định kết quả của PCR đa mồi. PCR đa mồi đặc hiệu allele hai hướng tích hợp công nghệ ARMS có ngưỡng phát hiện thấp hơn so với giải trình tự gene (0,1% so với 25%). Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công phương pháp phát hiện kiểu gene VEGF và kiểu đột biến gene EGFR với ngưỡng phát hiện (độ nhạy kỹ thuật) là 0,1-1% và độ đặc hiệu là 100%. Từ khóa: UTP, UTPKTBN, EGFR, VEGF, PCR đa mồi. ESTABLISHING ASSAYS FOR GENOTYPING VEGF AND IDENTIFYING EGFR MUTATIONS APPLYING FOR TARGET THERAPY OF LUNG CANCER SUMMARY Background: Personalised target therapies are widely approved for lung cancer, however, to optimize the therapeutic regimens, patients’ genetic background (EGFR, VEGF) must be clarified. Người phản hồi: Ngô Tất Trung Email: ntatrung@yahoo.com Ngày nhận bài: 21/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 12/2013 Ngày phản biện đánh giá bài báo cáo: 11/2013 TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI Số 15 tháng 12/ 2013 ISSN 1859 - 3925 25 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Aims: To set-up a molecular diagnostic protocol for detecting exon 19 Del19 (746-750), exon 21 pointmutation (L858R) of epithelial growth factor receptor (EGFR) and genotyping VEGF SNPs Rs3025039,RS833061. Materials and methods: Cell lines carrying mutation of EGFR were cultured by standard conditionsand treated as reference for optimizing the assays. Mutations of EGFR gene were detected by bidirectionalallele specific PCR combined with amplification refractory mutation system, its sensitivity and specificity weremonitored by titrating mutant positive cells in to mutant negative counterpart into a series from 0:100, 0.1:100,1:100, 10:100 and 100. On the other hand, allelic variants of VEGF was acquired by allele specific kineticsPCR with referring to Sanger sequencing. Results: Multiplex-PCR EGFR mutation assay can identify nucleotide modification at exon 19, exon 21with sensitivity is 0,1%; 1% and 1%, respectively. Sequencing had confirmed the results of multiplex-PCR butits sensitivity is less than multiplex-PCR (>5%). The concordance was also established between our novelVEGF allelic screening assay and Sanger sequencing. Conclusion: We have successful established assays for detecting mutation of EGFR screening forallelic variants of VEGF. Key words: Lung cancer, NSCLC, EGFR, VEGF, multiplex-PCR.I. ĐẶT VẤN ĐỀ giai đoạn muộn là Gefitinib, Erlotinib. Việc chỉ định sử dụng các dược phẩm này phụ thuộc vào trạng Ung thư phổi (UTP) là bệnh gây tử vong cao thái ...