Nguyên tắc cơ bản của PCR

Khái quát chung: PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước (xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 là biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài chuỗi theo...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nguyên tắc cơ bản của PCR Nguyên tắc cơ bản của PCR + Khái quát chung: PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADNtheo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu nhiệt,hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗimột chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 b ước (xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 làbiến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bước 2 là bắtcặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiênbản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởimồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kếtquả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ. Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid đượcthiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗicặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúngphải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy là do nếuchúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuyếch đại được đoạn geneđích. Với các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi được thiết kế thìchúng có thể nhân được gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong nhiều trườnghợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm PCR không đặchiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều được dùng cho định typ vi sinh vật. Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzymADN polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị biến tính tại 94 oC và nhưvậy cần phải bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá tr ình nàyđã được cải thiện do dùng enzym Taq ADN polymerase (Taq = Thermus aquaticus) chịu nhiệt. Enzym này được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng. Tốc độxúc tác cho phản ứng của enzym này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại755oC. Hoạt tính enzym giảm một nửa khi xử lý tại 92.5oC trong 230 phút hoặc 40phút tại 95oC. Như vậy khi dùng enzym này thì không cần bổ sung enzym mới saumỗi chu kỳ phản ứng. + Các thông số kỹ thuật: Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợikhuôn. Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạora sản phẩm nhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩnbị ADN theo phương pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phảnứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA (acideéthylène-diamine-tétraacétique) hoặc đệm phosphat vì kết quả sẽ làm giảm Mg++(do EDTA hoặc tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR cóthể nhân được đoạn gene dài 10 Kb nhưng trong thực tế thường dùng để nhân cácđoạn có kích thước ngắn hơn ( Taq polymerase 1U KCL 50 mM Tris HCL (pH 8.4) tại 25oC 10 mM MgCl2 2.85 mM Gelatin 100 mg/l Nonidet-40 0.05% Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều chú ýlà các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau, có tr ìnhtự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của các mồicũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiệntượng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay người ta có thể tối ưu hoá việc chọn mồi nhờsự trợ giúp của các chương trình máy tính. Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu,điều này thường hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin.Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản ứngcó thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành phần như nhiệtđộ, nồng độ Mg++ và enzym có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu. Sự có mặt củanonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất của phản ứng. Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR có thể là cách nhanhchóng để tìm sự khác biệt đối với các gene khác nhau. Với cách này yêu cầu sảnphẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Theo cách này trình tự có thể được thực hiệnnhư sau: Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến hành kết tủa vớiethanol. Kết tủa được hoà với đệm thích hợp và sau đó được xử lý với enzym cắthạn chế thích hợp. Kiểm tra kết quả thông th ường trên gel agarose, trong một sốtrường hợp có thể trên gel polyacylamid để thu được độ phân giải cao hơn. Chú ýrằng thông thường hoạt tính enzym giảm 5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậy có thểước lượng 50% hiệu quả khuyếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng. + Một số khó khăn với phản ứng PCR: PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử nhưngcũng nảy sinh một số vấn đề cần chú ý đặc b iệt khi phát hiện một số bệnh virushay vi khuẩn. Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả tế bào chết và tế bào sống đềucho kết quả dương tính trong phản ứng PCR. Phản ứng nhạy nên mọi sự nhiễmADN đều có thể đưa đến sản phẩm dương tính giả trong kết quả. Để hạn chế thựctế này cần tiến hành với các mẫu đối chứng cần thiết để biết được sự nhiễm tạp từcác thành phần phản ứng hay từ dụng cụ thí nghiệm. Một vấn đề nữa cũng cần đề cập là sai số trong phản ứng nhân gene vớienzym taq ADN polymerase. Sai sót thêm nucleotid xảy ra với mỗi một đơn vị saochép khoảng 9000 nucleotid và đột biến dịch khung xảy ra với số l ượng tương ứngkhoảng 40 000 nucleotid. + Một số kỹ thuật PCR khác: Một số kỹ thuật phát triển trên cơ sở của kỹ thuật PCR có ý nghĩa quantrọng cho định danh và định typ vi sinh vật là nested PCR (PCR lồng), reverttranstriptase PCR (sao chép ngược) và asymmetric PCR (PCR một chiều). PCRlồng là phản ứ ...