Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN

Kỹ thuật lai ADN đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này được khắc phục bằng...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN Kỹ thuật lai ADN đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typcủa nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khicác tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy khôngthể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợpkhác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các kỹ thuật lai hayđịnh typ. Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn ADN đích mộtcách nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân gene PCR. a. Kỹ thuật nhân gene PCR (Polymerase Chain Reaction) Việc nhân ADN cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơnnữa đối với đoạn ADN hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương pháp khác nhau đểphân tích nguồn ADN khuyếch đại theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất làsử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xácđịnh độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặchiệu đã được đánh dấu. Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định đượctrình tự ADN và ARN của sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗiADN sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vậtnghiên cứu. Kết quả xác định trình tự ADN còn cho phép xác định mối liên hệ tiếnhoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật. - Đôi nét về phản ứng chuỗi PCR: Phản ứng chuỗi PCR nhằm khuyếch đại ADN lần đầu tiên được Saki (1985)giới thiệu và đây được coi là một trong những tiến bộ khoa học quan trọng nhất vềsinh học trong thập kỷ 80. Phản ứng PCR sử dụng enzym chịu nhiệt tạo ra nhiềuphiên bản theo hàm số mũ. Có thể ví dụ, chỉ cần 1 sợi ADN sau vài giờ có thểnhân lên 1011 phiên bản ADN tương đương với 100 ng ADN. Sau khi thực hiệnphản ứng PCR thì cần tiến hành một số kỹ thuật để xác định sản phẩm, đơn giảnnhất là điện di và xác định kích thước của sản phẩm PCR. Trong các nghiên cứuchẩn đoán thì kết quả này rất có ý nghĩa, nó chứng tỏ sự có mặt của ADN đíchtrong mẫu nghiên cứu. Có thể nhận được tính đặc hiệu và độ nhạy cao hơn khi sửdụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR hoặc lai với mẫu dò đặc hiệu. Tuy nhiên,thông tin đầy đủ nhất vẫn là kết quả xác định trình tự ADN của sản phẩm PCR. Ngay từ khi được giới thiệu thì PCR đã được xem là phương pháp đưa lại kếtquả khá nhạy trong việc xác định và phát hiện vi sinh vật. Tính ưu việt của nó thểhiện ở chỗ có thể chỉ cần một hạt virus hay một tế b ào vi khuẩn nào đó cũng đủcho phản ứng xảy ra và khuyếch đại tới mức có thể phát hiện được trong thời gianngắn. Kỹ thuật PCR còn được dùng để nhân ADN từ khuôn RNA sau khi đã đượcchuyển thành cDNA sau phản ứng phiên mã ngược (RT). Phương pháp này nhanhchóng được chú ý và trở lên phổ biến cho các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn hayvirus ở nồng độ thấp trong các mẫu môi trường và bệnh phẩm. Ví dụ việc pháthiện mẫu máu nhiễm HIV có nghĩa là phát hiện phần nhỏ ADN của virus trong hệgene người có kích thước gấp 100 000 lần. Mặt khác khi dùng kỹ thuật miễn dịchvới kháng thể thì phải cần tới 8 ngày mới có đáp ứng miễn dịch trong máu, trongkhi đó với kỹ thuật PCR thì toàn bộ quy trình phát hiện chỉ mất vài giờ (đối vớinguồn ADN hay RNA). Lợi thế của kỹ thuật PCR được tận dụng cho việc chuẩnbị ADN làm mẫu dò với số lượng lớn cho các phép lai ADN đã trình bày ở trên.Các mẫu dò có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hay phi phóng xạ khi tiến h ànhphản ứng khuyếch đại. Mẫu dò đánh dấu với kỹ thuật PCR có ưu thế hơn cácphương pháp đánh dấu truyền thống bằng kỹ thuật tổng hợp các mạch đứt gãy(nick translation) hay đánh dấu với mồi ngẫu nhiên (rADN random primerlabeling). Các ưu thế này có thể kể đến, cụ thể như là cần lượng nhỏ sợi ADNkhuôn, có thể tiến hành đánh dấu với các mẫu dò có kích thước ngắn, chuẩn bịmẫu dò không cần tinh sạch ADN khuôn. Bảng 1.7. dưới đây liệt kê một số ví dụứng dụng kỹ thuật PCR cho phát hiện nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau. Rấtnhiều các kết quả nghiên cứu như vậy được trình bày trong các tạp chí chuyênngành như: ành như: ành như: ành như: Journal of Clinical Microbiology, AppliedEnvironmental Microbiology.Bảng 1.7. Một số ví dụ về ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định vi sinh vât.Vi sinh vật Tài liệuAcanthamoeba sp Vokin et al (1992)Bordetella pertussis Houard et al (1989)Borrelia burgdorferi Marconi ADN Garon (1992)Brucella sp Herman an Derider (1992)Candida albicans Miyakawa et al (1992)Carnobacterium spp Brook et al (1992)Chlamydia trachomatis Hayes et al (1992)Clostridium difficile Gumerlock et al (1991)Coxiella burneti Stein an Raoult (1992)Cryptosporidium parvum Laxer et al (1991)Cytomegalovirus Gozlan et al (1991)Dengue virus Henchal et al (1991)Epstein-barr virus Samoszuk (1991)Erwinia amylovora Bereswill etal (1992)Escherichia coli Jackson (1992)Frankia spp Simonet et al (1990)Gaeumannomyces spp Henson (1992)Helicobacter pylori Claton et al (1992)Hepatitis C virus Okamoto et al (1992)Human immunodeficiency virus Dawood et al (1992)(HIV) Claas et al (1992)Influenza virus Merien et al (1992)Leptospira spp Niederhauser et al (1992)Litsteria monocytogenees Robertson et al (1991)Luteovirus Hackel et al (1990)Mycobacterium leprae Altamirano et al (1992)Mycobacterium tuberculosis Maiden et al(1992)Neisseria meningitis Charlotte et al (1993)Papillomavirus McOmish et al (1993)Parvovirus Barker et al (1992)Pls ...