nuôi cấy mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
nuôi cấy mô sẹo NUÔI CẤY MÔ SẸO1. GIỚI THIỆUNuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọngtrong nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo lànguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứuquan trọng khác như: phân hóa mô và tếbào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bàotrần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôisoma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạttính sinh học…Mô sẹo là một khối tế bàokhông có tổ chức, hình thành từ các môvà các cơ quan phân hóa dưới các điềukiện đặc biệt (có vết thương, xử lý cácchất điều hoà sinh trưởng thực vật…).Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quannày phải chịu một sự phản phân hóatrước lần phân chia đầu tiên. Nhìn chungsự tạo mô sẹo invitro (nhờ auxin tácđộng) do 3 quá trình:- Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ítnhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồmcác tế bào nhu mô mộc và libe, nhu môvỏ hay lõi.- Sự phân chia của các tượng tầng: các tếbào tượng tầng của phần lớn STD dễdàng phân chia dưới tác động của auxinthấm chí không cần auxin ngoại sinh nhưở các loài cây cỏ hay dây leo.- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơkhởi (chồi hay rễ) quá trình này được ưutiên áp dụng ở ĐTD, vì các cây nàytượng tầng thiếu và nhu mô khó phảnphân hoá so với STD Màu sắc của môsẹo không giống nhau trên các môitrường nuôi cấy khác nhau hay trên cácbộ phận khác nhau và chúng thường cómàu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…Nồng độ và loại kích thích tố sử dụngtrong môi trường nuôi cấy là những yếutố có ảnh hưởng đến sự hình thành vàphát triển mô sẹo. Thường mô sẹo đượchình thành trên môi trường giàu auxin; cóthể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp vớinhau hoặc có thể kết hợp với cytokinintuỳ từng loại cây.Hàm lượng hormon nội sinh và chiều dichuyển của các hormon này trong mẫucấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh môsẹo. Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫucấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trườngnuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinhmô sẹo dẫn đến những phản ứng khácnhau của mẫu cấy.Với một số cây thì vấn đề này khôngquan trọng nhưng cũng có một số câychịu ảnh hưởng rất lớn.2. THỰC HÀNH2.1. Mục đích:Khảo sát sự phát sinh mô sẹo từ các bộphận khác nhau ở cây thuốc lá2. 2 Vật liệu2.2.1 Môi trường nuôi cấyMS (20g/l đường) có bổ sung 0.1µM 2,4-D và 1µM 2,4-D2.2.2 Nguyên liệu thực vậtCây con thuốc lá in- vitro2.2.3 Hoá chất và dụng cụ- Nuớc cất vô trùng- Dao, kẹp, đĩa cấy, giấy cấy…2. 3. Các bước thực hiệnCẩn thận gắp cây con in-vitro ra khỏibình nuôi cấy. Tránh kẹp quá mạnh làmdập mẫu cấy (hình A)- Dùng dao cấy cắt đoạn rễ, lóng thân vàlá chuyển qua một dĩa cấy khác để xử lýmẫu (hình B)- Lá: cắt bỏ gân lá và rìa lá. Phần lá cònlại được cắt thành nhiều mảnh nhỏ vớikích thước 0,8 -1mm x 8 –10mm. Đặtcác mảnh lá này nuôi trên các đĩa petrichứa môi trường MS + 1µM 2,4-D BC- Lóng thân: chọn các đoạn lóng thân cóđường kính 2-2,5mm được cắt lát mỏng0,05 – 0,1mm bằng lưỡi dao thật sắc. Cáclát cắt được đặt nằm trên các đĩa petrichứa môi trường MS + 1µM 2,4-DRễ: Rửa sạch agar bằng nước cất vôtrùng, cắt nhỏ thành từng đoạn 1-1,5mmđặt lên các đĩa petri có chứa môi trườngMS + 0.1µM 2,4-D- Dùng nhựa nylon cuốn quanh mép đĩapetri để đảm bảo sự vô trùng trong thờigian nuôi cây.- Ghi rõ số nhóm, tên mẫu cấy, tên môitrường và ngày cấy.- Đặt nuôi trong tối4. Yêu cầu:- Thao tác xử lý mẫu cấy tốt, lát cắt dứtkhoát càng mỏng càng tốt; tránh dập mẫu- Ghi nhận và so sánh thời gian phát sinhsẹo, hình dạng và màu sắc khối mô sẹo,vị trí phát sinh sẹo từ các mẫu cấy khácnhau.