Phân lập gen mã hóa protein vận chuyển lipit (LTP2) từ mRNA phục vụ chuyển gen ở cây đậu xanh

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng giống đỗ xanh Mỹ Đức-Hà Nội (HN2) để phân lập gen LTP2 từ mRNA. Kết quả phân tích trình tự gen LTP2 cho thấy, gen phân lập được có độ dài 351 bp, mã hóa cho 116 amino acid. Kết quả này là cơ sở để tạo cây trồng chuyển gen mang gen LTP, tăng cường tính chống chịu với điều kiện mất nước và khô hạn.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân lập gen mã hóa protein vận chuyển lipit (LTP2) từ mRNA phục vụ chuyển gen ở cây đậu xanhNguyễn Vũ Thanh Thanh và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ85(09)/1: 127 - 131PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA PROTEIN VẬN CHUYỂN LIPIT (LTP2)TỪ mRNA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU XANHNguyễn Vũ Thanh Thanh1*, Võ Minh Hòa1,Hoàng Hà2, Lê Văn Sơn2, Chu Hoàng Mậu31Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái NguyênViện Công nghệ sinh học,3 Đại học Thái Nguyên2TÓM TẮTLipid Transfer Protein (LTP) là protein có khả năng vận chuyển lipid qua màng tế bào và liên quanđến tính chịu hạn ở thực vật. Khi gặp hạn, LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật cóthể giảm mất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài. Những nghiên cứu trên cây đậu xanh đã chothấy hàm lượng mRNA của LTP sẽ tăng lên trong các điều kiện bất lợi như hạn, mặn hay khi hàmlượng ABA ngoại bào cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng giống đỗ xanh Mỹ Đức-HàNội (HN2) để phân lập gen LTP2 từ mRNA. Kết quả phân tích trình tự gen LTP2 cho thấy, genphân lập được có độ dài 351 bp, mã hóa cho 116 amino acid. Kết quả này là cơ sở để tạo cây trồngchuyển gen mang gen LTP, tăng cường tính chống chịu với điều kiện mất nước và khô hạn.Từ khóa: Đậu xanh, gen LTP, chịu hạn, phân lập gen.MỞ ĐẦU*Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek) là câytrồng cạn có vai trò quan trọng bởi nó cungcấp protein và có tác dụng cải tạo đất. Tuynhiên, đậu xanh là cây trồng chịu hạn kém.Để nâng cao khả năng chịu hạn của cây trồngnói chung và cây đậu xanh nói riêng, hiện naycác nhà khoa học thường tạo cây chuyển genmang một hoặc một số gen liên quan đến khảnăng chịu hạn. LTP thuộc họ genpathogenesis relate, là một trong các gen chứcnăng có liên quan đến khả năng chịu hạn. Vaitrò của LTP là tham gia vào quá trình sinhtổng hợp biểu bì ở thực vật giúp hạn chế sựmất nước trong điều kiện khô hạn [1], [2], [4].Các nghiên cứu đã cho thấy LTP có khả năngtạo phức với một số acid béo và xúc tác choquá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào.LTP được gắn tại một vị trí cố định trên màngsinh chất của tế bào, nó có đặc điểm như mộtreceptor vận chuyển acid béo qua màng tếbào. Phức hợp LTP-linoleic acid đã đượcchiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc látrong điều kiện gây hạn nhân tạo [5]. LTP đãđược chiết ra từ protein ở các loài thực vậtkhác nhau và hàm lượng cao nhất LTP đãđược tìm thấy ở lớp biểu bì bên ngoài cũngnhư xung quanh các gân lá. Gen LTP điềukhiển và tổng hợp nên các sản phẩm proteintương ứng tham gia xúc tác sự vận chuyểnphospholipid giữa các lớp màng tế bào, hỗ trợviệc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúpcây hạn chế mất nước [3].*Tel: 0912664126; Mail: thanhthanhdhkhtn@gmail.comSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái NguyênHiện nay , cùng với sự phát triển của côngnghệ sinh học , các nghiên cứu sinh học phântử, di truyền và hóa sinh liên quan đến tínhchịu hạn mới ở thực vật đã được làm sáng tỏ.Nhiều gen mới đã được phát hiện và đượcnghiên cứu chức năng trên các đối tượng câymô hình khác nhau . Trong đó có gen mã hóaLipid Transfer Protein (LTP) liên quan đếnsinh tổng hợp lớp biểu bì của cây trồng . Đâylà cơ sở quan trọng cho việc cải tạo giống câytrồng, nhằm tăng khả năng chống chị u.Dựa vào trình tự của gen mã hoá protein LTPđã công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế vớimã số AY300807, chúng tôi đã thiết kế cặpmồi đặc hiệu để khuếch đại gen mã hoá proteinLTP2 của đậu xanh bằng kỹ thuật RT-PCR,nhằm phục vụ cho việc thiết kế vector chuyểngen. Gen LTP được nhân lên bằng phươngpháp RT-PCR sau đó gắn vào vector để dònghoá và xác định trình tự nucleotide của gen.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUVật liệuGiống đậu xanh địa phương của Mỹ Đức-HàNội (kí hiệu HN2) có đặc điểm: năng suấtcao, vỏ hạt màu xanh mỡ, khối lượng 1000hạt khoảng 57,32 g.Phương phápRNA tổng số được tách từ lá cây đậu xanh sửdụng kit Trilzol Regents (Invitrogen).TừRNA tổng số chúng ta tiến hành tổng hợpcDNA được tạo ra trong 20 l dung dịch cóchứa 5 g RNA tổng số; 200 ng mồi ngẫunhiên; 2 l dNTPs 10 mM; bổ sung nước khử127http://www.lrc-tnu.edu.vnNguyễn Vũ Thanh Thanh và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ81(05): 127 - 131ion tới thể tích 13 l. Dung dich phản ứngnày được ủ ở nhiệt độ 65oC trong 5 phút, sauđó giữ ở nhiệt độ 4oC. Tiếp theo bổ sung 4 lđệm 5X RT tổng hợp cDNA; 1l DTT 0,1 M;1 l chất ức chế ribonuclease tái tổ hợpRNase OUTTM (40 đơn vị/l); 1 l clonedAMV RT (15 đơn vị/l) vào dung dịch trêntrước khi thực hiện chu kì nhiệt như sau: 01chu kì 25oC trong 10 phút, 01 chu kì 45oCtrong 50 phút, 01 chu kì 85oC trong 5 phút vàgiữ ở 4oC.Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Trìnhtự nucleotide của gen LTP2 được xác địnhtrên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABIPRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer củahãng Ampplied Biosystem. Kết quả đọc trìnhtự gen được xử lý bằng phần mềm DNAstarvà BioEdit.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNKết quả thiết kế mồi, tách mRNA và RTPCR nhân gen LTP2Thiết k ...