Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase

Trong bài viết này, hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 chọn lọc được, có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzyme làm tan huyết khối (nattokinase). Trên môi trường hạt đậu nành, chiều dày môi trường 2,5 cm, nhiệt độ phòng, sau 40 giờ lên men, hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 sinh ra nattokinase (470 FU/g), chiếm khoảng 70-85% so với hoạt tính protease tổng.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp NattokinaseTẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 99-104PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUSSINH TỔNG HỢP NATTOKINASELê Thị Bích Phượng*, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong,Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị HươngViện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)phuongbl58@yahoo.comTÓM TẮT: Nattokinase là enzyme làm tan huyết khối, được phát hiện trong Natto vào năm 1980. Trongbài báo này, hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 chọn lọc được, có khả năng sinh tổng hợp mạnhenzyme làm tan huyết khối (nattokinase). Trên môi trường hạt đậu nành, chiều dày môi trường 2,5 cm,nhiệt độ phòng, sau 40 giờ lên men, hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 sinh ra nattokinase (470FU/g), chiếm khoảng 70-85% so với hoạt tính protease tổng. Kết quả này cho thấy rằng, chúng ta có thểchủ động sản xuất sản phẩm nattokinase hoạt tính cao, giá thành thấp để vệ sức khỏe người dân, mà khôngphụ thuộc vào thực phẩm chức năng chứa enzyme nattokinase ngoại nhập.Từ khóa: Bacillus, enzyme làm tan huyết khối, nattokinase.MỞ ĐẦUHiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạchdo các cục máu đông (thrombus) như chứng nhồimáu cơ tim hay nhồi máu não đang tăng cao ởViệt Nam cũng như trên thế giới. Vì vậy, enzymenattokinase được quan tâm nghiên cứu sản xuấtvà sử dụng rộng rãi để phòng ngừa bệnh nghẽnđộng mạch do các cục máu đông [9].Nattokinase (EC 3.4.21) là serine proteasegồm 275 axít amin, hoạt động ở pH tối ưu từ 810, nhiệt độ tối ưu từ 30-70oC, có trọng lượngphân tử từ 27,7-44 kDa, điểm đẳng điện (pI)8 và cấu trúc tương đồng với subtilisin. Cơ chếhoạt động của nattokinase là trực tiếp phân cắtfibrin trong huyết khối và gián tiếp bằng cáchhoạt hoá sự sản xuất urokinase và plasmintrong mô [7].Nhiều chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus phânlập từ các loại thực phẩm lên men truyền thống lànguồn giống quan trọng có khả năng sản xuất cácenzym làm tan huyết khối, như B. natto phân lậptừ thực phẩm Natto, Nhật [3], Bacillusamyloliquefaciens DC-4 từ Douchi, Trung Quốc[8], Bacillus sp. CK 11-4 TỪ Chungkook-Jang vàBacillus sp. DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc [4, 5].Nattokinase được tinh sạch từ dịch nuôi cấyB. subtilis natto B-12 (phân lập được từ natto)có độ tinh sạch gấp 51,6 lần và hiệu suất thu hồi43,2% so với hoạt tính ban đầu, trọng lượngphân tử 29 kDa, hoạt động ở pH và nhiệt độ tốiưu tương ứng là 8 và 40oC, enzyme được hoạthóa bởi ion Zn2+ nhưng bị ức chế bởi ionFe3+ vàAl3+ [14].Chủng B. subtilis được nuôi cấy chìm chứaglucose 10 g/l, peptone 50 g/l và các chấtkhoáng; ở điều kiện trong bình tam giác sau 12giờ nuôi cấy, hoạt tính nattokinase là 630UI/ml; ở điều kiện trong nồi lên men, sau 10 giờnuôi cấy, hoạt tính nattokinase cao nhất là 3,400UI/ml. Tuy nhiên, ở điều kiện nuôi cấy theo mẻcó bổ sung cơ chất dinh dưỡng trong nồi lênmen, sau 19 giờ nuôi cấy, hoạt tính nattokinaselà 7,100 UI/ ml, cao gấp 2,1 lần so với không bổsung cơ chất [2].B. subtilis sinh tổng hợp nattokinase cao(459,11 FU/ml) trong môi trường lỏng chứa caocám mì (1,5-3o Brix), cao đậu nành (1,0-2oBrix),glucose (0,6-2%), trong thời gian 24-36 giờ ở27oC [11].Trong môi trường lỏng chứa peptone từ đậunành 8,28 g/l, CaCl2 0,64 g/l và cao nấm men0,74 g/l, B. natto NLSSE sinh tổng hợpnattokinase đạt 1300 UI/ml [6].B. subtilis LD-8 sinh tổng hợp nattokinasecao trong môi trường lỏng chứa bột gạo 5%, bộtđậu nành 4%, NH4NO3 0,5% và CaCl2 0,01%(w/w), pH 7 và tỷ lệ giống 5%, sau 72 giờ nuôicấy, hoạt nattokinase đạt được là 4220 U/ml [13].B. subtilis được nuôi cấy trên cơ chất bã bậunành (độ ẩm 80%), ở 37oC trong 20 giờ, hiệusuất nattokinase cao nhất là 0,108 g/150 g cơchất (dạng ướt) [15].99Le Thi Bich Phuong et al.Bacillus natto được nuôi cấy trong môitrường lỏng tối ưu: glucose 0,065%; KH2PO40,0016% và MgSO4 0,0016%, sau 72 giờ nuôicấy trên máy lắc ở 37o C, hoạt tính nattokinaseđạt được 12,34 FU/ml [12].B. subtilis được nuôi trên môi trường lênmen bán rắn chứa cơ chất bã đậu và cám mì,dưới các điều kiện nuôi cấy tối ưu như độ ẩmban đầu 65%, pH 8, và nhiệt độ 35o C, hoạt tínhnattokinase đạt được là 1577 UI/g [1].Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành mộtsố thực phẩm chức năng chứa nattokinase dướidạng viên nhộng nhập khẩu từ Nhật Bản, HoaKỳ như Nattospes (3000 FU/g), Japato (600FU/g), Nattokinase plusTM (3000 FU/g), Dosaka(300 FU/g)... với đơn giá rất cao (trên 10 triệuđồng/kg). Dạng thực phẩm truyền thống củaNhật Bản cũng được nhập khẩu nhưng khôngđược dùng phổ biến vì nặng mùi, nhớt, rất khóăn, không phù hợp với khẩu vị người Việt Nam,hoạt tính nattokinase cũng thấp.Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này nhằmchủ động nguồn giống bằng cách tuyển chọnmột số chủng Bacillus spp. từ bộ sưu tập giốngcủa Viện Sinh học nhiệt đới và phân lập từ thựcphẩm Natto có khả năng sinh tổng hợp mạnhnattokinase trên cơ chất đậu nành, so sánh hoạttính nattokinase thu nhận được từ các ch ...