phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt)

Chuẩn bị ADN khuôn: Sợi khuôn cần được hiểu là việc giải trình tự được thực hiện với sợi đơn (vectơ M13) hay sợi đôi ADN. Việc đọc trình tự theo sợi đơn thường cho kết quả là kích thước đoạn gene đọc dài và độ chính xác cao. Ngày nay người ta thường đọc sợi đôi vì việc chuẩn bị mẫu dễ dàng hơn, ngoài ra khi sử dụng hai phản ứng với hai mồi tương thích thì quá trình đọc lại chính xác hơn. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt) Một số điểm cần được chi tiết thêm cho mỗi bước như sau: 1, Chuẩn bị ADN khuôn: Sợi khuôn cần được hiểu là việcgiải trình tự được thực hiện với sợiđơn (vectơ M13) hay sợi đôi ADN.Việc đọc trình tự theo sợi đơnthường cho kết quả là kích thướcđoạn gene đọc dài và độ chính xáccao. Ngày nay người ta thường đọcsợi đôi vì việc chuẩn bị mẫu dễdàng hơn, ngoài ra khi sử dụng haiphản ứng với hai mồi tương thíchthì quá trình đọc lại chính xác hơn.Đó là ưu thế của cách đọc sợi đôiADN. Do vậy, rất cần đọc kết quảtừ cả hai sợi ADN. Hiện nayphương pháp đọc trình tự ADNtrực tiếp từ sản phẩm PCR đangngày càng trở lên phổ biến. 2, Chuẩn bị sợi ADN mồi chobước bắt cặp vào sợi khuôn: Người ta có thể dùng các đoạnADN mồi tiêu chuẩn đặc hiệu chotrình tự ADN của vectơ gần sát vớisợi khuôn hay primer đặc hiệu củasợi khuôn mà nó sẽ bắt cặp vào.Tiện ích của việc dùng mồi chuẩn ởchỗ mọi điều kiện đã được lựa chọncho sợi khuôn và mồi được dùnglặp đi lặp lại nhiều lần cho các sợikhuôn khác nhau. Hạn chế của loạimồi này ở chỗ chỉ đọc được mộtđoạn ngắn của gene (300 – 500bps) trong trường hợp phải đọc cácgene có kích thước lớn cần phảitiến hành subclone để đọc tiếp.Điều này có thể thực hiện bằngcách tạo ra các đoạn ADN ngẫunhiên từ toàn bộ gene sau đó lạigắn vào vectơ để đọc cho hết trìnhtự của gene. Phương pháp tiếp theo là sửdụng mồi được thiết kế theonguyên tắc bổ sung với trình tự củagene. Theo cách này, lần lượt cácđoạn được đọc mà không cần thaotác subclone. Tuy nhiên theo cáchđoạn mồi được thiết kế để đọc genenhư vậy thì điều kiện cho từngphản ứng giải trình tự ADN với cácmồi khác nhau sẽ không được tốiưu. Tuy vậy, hiện nay việc tổnghợp mồi đã trở nên dễ dàng và phổbiến với giá thành thấp, hơn thếnữa với sự trợ giúp của tin học thìbước thiết kế mồi đã được tối ưuhoá. Vì vậy phương pháp này ngàycàng trở lên thông dụng hơn. Saukhi mồi đã được thiết kế thì việctiếp theo là chọn cách đánh dấu vàomồi hay vào đoạn ADN sẽ đượctổng hợp. Ưu thế của việc đánh dấungay tại đầu 5’ của mồi ở chỗ cácbăng ADN thường có cùng mộtcường độ tín hiệu. Thông thườngvới phương pháp đọc trình tự thủcông thì P32 thường được dùng. Ưuthế của nó là mang gốc photphatcao năng bêta mạnh, do đó chỉ cầntrong thời gian ngắn là thu được tínhiệu. Hạn chế của phương pháp nàylà do mang năng lượng cao nên khóphân biệt giữa các băng khác nhauso với dùng S35. Hiện nay để giảiquyết vấn đề này người ta dùngP33 tuy giá thành cao nhưng cho kếtquả tốt hơn. 3, Thực hiện phản ứng giảitrình tự ADN: Enzym thông dụng thường dùnglà sequenase (là một dạng của T7DNA polymerase), enzym này cóưu thế hơn hẳn so với Klenow đượcdùng trước đây. Phản ứng đượcthực hiện nhanh hơn và thu được ++kết quả tối ưu nếu có mặt ion Mn ,ion này giúp cho quá trình sao chépcó độ chính xác cao. Trước đâydNTPs đánh dấu với P32 được dùngđể đánh dấu sản phẩm. Tuy nhiênngày nay nhiều người đã chuyểnsang dùng S35 thay thế cho P32, kếtquả là cho độ phân giải cao hơn. Mới đây phương pháp giải trìnhtự dựa trên kỹ thuật PCR được gọilà chu kỳ giải trình tự trực tiếpADN đang thay thế phương phápcũ dùng enzym sequenase. Vềnguyên tắc thì các phương phápnày là giống nhau. Ưu thế củaphương pháp này là: lượng ADNđòi hỏi ít và không yêu cầu phải cómức độ tinh sạch cao. Ngoài ra, cómột ưu điểm nữa là phản ứng xảyra ở nhiệt độ cao, do đó đã khắcphục được những hạn chế của cácphương pháp khác khi giải trình tựđối với các sợi khuôn có cấu trúcbậc 2 (Fan & cộng sự, tạpchí Biotechniques 21: 1132-1137). 4, Tách sản phẩm trên gelurea-acrylamid: Cho đến nay đã có nhiều tiến bộtrong kỹ thuật điện di gel kể từ năm1970 khi mà người ta phát hiện raphương pháp này. Tiến bộ quantrọng nhất là gel gradient tạo ra độdãn cách thích hợp để đọc đượcthêm từ 50-100 base. Đầu tiên,gradient được tạo ra giữa acrylamidvà gradient muối khi đổ gel. Có thểcó cách khác nữa là người ta thayđổi độ dày của gel bằng spacer.Phương pháp dễ nhất là bổ sungnồng độ muối NaOAc vào bể đệmdưới khi chạy gel, kết quả sẽ tạo ramột gradient cần thiết mà khôngmấy khó khăn. Có nhiều cách cải tiến khácnhau để tạo ra gel có độ phân giảicao, ví dụ tạo ra gradient đối vớiacrylamid mạch thẳng hay bổ sungmột số chất tạo ra gradient (LongRanger). Mặt khác việc đổ gel cũngđược đơn giản hóa bước sử dụngbăng dán. Một số người dùng cácgel siêu mỏng để đạt độ phân giảicao. Nhiều thiết bị được phát minhnhằm thu nhận các băng đã đượctách riêng khi chúng ra khỏi gel, vàgần đây những thiết bị này đã đượcthương mại hóa. Nhuộm bạc là phương pháptương đối hiệu quả để xác định cáctrình tự ADN, cách này hạn chếđược nhiều bước dùng trong các kỹthuật dựa vào ảnh bức xạ mà khôngcần sử dụng chất phóng xạ. 5, Đọc trình tự gene: Hiện nay kỹ thuật đọc phim tựđộng đã thay thế công việc đọctrìn ...