phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt)

Cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời gian. Sử dụng cơ chất phát xạ huỳnh quang là phương pháp khá nhạy và có thể phát hiện được tới một phân tử chất phát xạ (fluorescein). Nói chung với các mẫu sinh phẩm thường có mức độ nhiễu tín hiệu nền cao. Thực tế này có thể được cải thiện với cơ chất fluorophore bền bị kích hoạt bởi sóng ánh sáng.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt)3, Cơ chất huỳnh quang và phátxạ huỳnh quang theo thời gian. Sử dụng cơ chất phát xạhuỳnh quang là phương pháp khánhạy và có thể phát hiện được tớimột phân tử chất phát xạ(fluorescein). Nói chung với cácmẫu sinh phẩm thường có mức độnhiễu tín hiệu nền cao. Thực tế nàycó thể được cải thiện với cơ chấtfluorophore bền bị kích hoạt bởisóng ánh sáng. Sự phát xạ sau đóđược ghi lại khi các bức xạ nền đãbị giảm. Đối với phương pháp dùngAlkaline phosphatase thì việc pháthiện nhân tố gắn lanthanide theothời gian đi kèm với hoạt tínhenzym này gọi là phương pháp phátquang lanthanide khuyếch đại bởienzym (EALL: Evangelista,Pollack & Templeton, 1991). Trongtrường hợp này, cơ chất không cókhả hình thành phức hệ gắn vớilathanide phát xạ. Dưới tác dụngcủa Alkaline phosphatase thì cơchất và lanthalide bị chuyển thànhphức hệ hoạt động. Phương phápnày khá nhạy nhưng hạn chế lớnnhất của nó là cần thiết bị kích hoạtvà đo bức xạ huỳnh quang. + Quá trình lai: Nói chung quá trìnhlai (Hybridization ) được tiến hànhtheo một trong 3 cách sau để địnhdanh hay xác định vi sinh vật: Laivới vi sinh vật (in situ), lai trongdịch thể và lai với chất mang (solidsupport). a. Kỹ thuật lai với vi sinh vật (in situ), hình 1.4. Hình 1.4. Minh hoạ kỹ thuật lai in situ với kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridization) phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori. Kỹ thuật này được thực hiện đểđịnh vị chuỗi acid nucleic trong visinh vật sau khi đã được cố địnhtrong các tiêu bản hiển vi. Tuynhiên, do hầu hết các vi sinh vật cókhả năng thấm (hay cho phép) cácđoạn ngắn oligonucleotid đánh dấuđi vào tế bào sau khi cố định mẫuvì vậy khi sử dụng mẫu dò đánhdấu với chất nhuộm huỳnh quangđặc biệt có thể nhìn thấy được trựctiếp vi sinh vật dưới kính hiển vihuỳnh quang. Điều đáng chú ý làphản ứng lai phải tiến hành trongthiết bị được hàn kín nhằm hạn chếviệc bay hơi của dịch lai. Việc bayhơi dịch lai này dẫn đến việc bámkhông đặc hiệu của chất nhuộmhuỳnh quang với tế bào. Nhiệt độlai phụ thuộc vào oligonucleotidmẫu dò. Sau phản ứng lai thì mẫuphải được xem ngay hoặc được bảoquản trong tối trong thời gian 6tháng. Nếu mẫu dò đặc hiệu choRNA thì độ nhạy tăng lên rất lớn vìcó tới hàng ngàn bản copy củaRNA trong mỗi tế bào (Stahl vàAmman, 1991). Lai trong môi trường dịchthể: Phản ứng lai trong môi trườngdịch thể xảy ra nhanh hơn nhiều sovới môi trường có chất mang pharắn (soild). Do cả phân tử ADNđích và mẫu dò đều có thể di độngtự do trong môi trường do đó phảnứng đạt kết quả cao nhất. Nóichung với phép lai thực hiện trongdịch thể thì thời gian kết thúcnhanh hơn từ 5-10 lần so với trongđiều kiện là chất mang (Bryan, etal., 1986). Tuy nhiên, cũng có thểbổ sung thêm chất mang làm tăngphản ứng lai. Cần thêm bước cuốicùng là tách phức hợp mẫu dò-sợiADN đích. Hạn chế ở đây là mẫutrong dịch cho nên có thể tạo lêncác nền kém đặc hiệu, do vậy cầncác giải pháp làm hạn chế mức độnhiễu của nền cho thích hợp. Hình 1.5. Minh hoạ kỹ thuật lai trong môi trường dịch thể. Trên thực tế hầu hết các KITthương phẩm dùng cho vi sinh vậtđều tiến hành trong môi trườngdịch thể. Vi sinh vật trong mẫu đầutiên được phân giải trong điều kiệnthích hợp để ADN đích lai với mẫudò. Sau đó là bước lai và tách phứchệ mẫu dò và ADN đích dựa vàocác thông số của phép lai theo kiểukẹp díp cụ thể. Các phép lai theokiểu kẹp díp (hình 1.9) cần có haiđoạn ADN có trình tự khác nhau;một đoạn để bám giữ ADN đíchgắn vào chất mang và một đoạn làmẫu dò. Điều quan trọng là haiđoạn ADN này phải có trình tựkhác nhau cho dù chúng đều gắnvới hai vùng khác nhau trên đoạnADN đích theo nguyên tắc bổ sung.Mẫu dò đánh dấu được bổ sung vàotrong dung dịch có các đoạn ADNđích nghiên cứu. Như vậy theo hìnhvẽ phức hợp ADN mẫu dò đánhdấu để phát hiện gắn với ADN đíchvà phức hợp mẫu dò- ADN đíchgắn vào chất mang đã được hìnhthành. Phức hợp này được tách rakhỏi dung dịch và khi có mặt cơchất thích hợp để phát hiện đượcmẫu dò đánh dấu. Khi dùng hệthống phát hiện dựa vào các hoáchất huỳnh quang hay tạo màu cóthể dùng thiết bị phát hiện kết quảmột cách tự động. + Kỹ thuật lai dựa vàomàng: Tác giả đầu tiên giới thiệu kỹthuật cố định ADN trên màng làNygaard và Hall (1963, 1964). Sauđó chính Southern (1975) là ngườimô tả việc tách ADN khỏi gel saukhi điện di và chuyển chúng lênmàng nitrocellulose. Các đoạnADN đích được phát hiện bằng kỹthuật lai và đây là bước tiến quantrọng của sinh học phân tử. Từ năm1977 đến nay đã có nhiều cải tiếnvề phép lai cũng như bước chuyểnADN lên màng của các tác giả khácnhau như: Meinkoth và Wahl(1984). Người ta cũng đã sử dụngmột số màng nynol, màngnitrocellulose hoạt hoá hay có độbền cho các phép lai. Đối với côngviệc định loại vi sinh vật với kỹthuật cố định trên màng cho phéplai A ...