phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt)

Khái quát chung: PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt) 2.3. Nhân gene và kỹ thuật giảitrình tự ADN. Sau đây là những nét chungnhất của kỹ thuật PCR: Nguyên tắc cơ bản của PCR: + Khái quát chung: PCR là phương pháp dùngenzym khuyếch đại chọn lọc mộtđoạn ADN theo luật số mũ. Phảnứng nhân gene được thực hiện vớienzym ADN chịu nhiệt, hai mồitổng hợp và 4 loạideoxyribonucleic (dATP, dGTP,dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳphản ứng nhân gene gồm 3 bước(xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 làbiến tính ADN, có tác dụng táchhai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép.Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào haisợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéodài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ vớiquá trình trùng hợp gắn các dNTPdọc theo sợi khuôn để tạo thànhphiên bản mới theo nguyên tắc bổsung. Tính đặc hiệu của phản ứngđược quy định bởi mồi và sự saochép trực tiếp theo trình tự sợikhuôn giữa hai mồi. Như vậy, kếtquả tạo ra hàng triệu phiên bản sợikhuôn trong vài giờ. Mồi cho phản ứng là các đoạnADN có kích thước 20-30nucleotid được thiết kế theo trình tựcủa đoạn gene cần khuyếch đại dựatheo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồiphải hoàn thành chức năng củamình trong toàn bộ phản ứng, tức làchúng phải bám đặc hiệu vào đúngvị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ nhưvậy là do nếu chúng không bámvào vị trí đặc hiệu thì không thểkhuyếch đại được đoạn gene đích.Với các gene có độ bảo thủ cao nhưrADN thì khi cặp mồi được thiết kếthì chúng có thể nhân được gene từnhiều đối tượng. Ngược lại, trongnhiều trường hợp dùng mồi khôngđặc hiệu thì có thể nhân được cácsản phẩm PCR không đặc hiệu.Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đềuđược dùng cho định typ vi sinh vật. Thí nghiệm phản ứng PCR lầnđầu tiên dùng mảnh Klenow củaenzym ADN polymerase Itừ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị obiến tính tại 94 C và như vậy cầnphải bổ sung enzym mới sau mỗichu kỳ phản ứng. Đến nay quá trìnhnày đã được cải thiện do dùngenzym Taq ADNpolymerase (Taq = Thermusaquaticus ) chịu nhiệt. Enzym nàyđược tách ra từ vi khuẩn sống ởsuối nước nóng. Tốc độ xúc tác chophản ứng của enzym này rất nhanh,có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại o755 C. Hoạt tính enzym giảm mộtnửa khi xử lý tại 92.5oC trong 230phút hoặc 40 phút tại 95oC. Nhưvậy khi dùng enzym này thì khôngcần bổ sung enzym mới sau mỗichu kỳ phản ứng. + Các thông số kỹ thuật: Bất kỳ một phản ứng PCR nàocũng bắt đầu bằng việc tách ADNlàm sợi khuôn. Nói chung, theo lýthuyết chỉ cần một sợi khuôn cũngđủ cho phản ứng tạo ra sản phẩmnhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn bịADN theo phương pháp đơn giảnkhông cần tinh sạch cũng phù hợpcho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điềuquan trọng là tránh sự có mặt củaEDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) hoặc đệm phosphatvì kết quả sẽ làm giảm Mg++ (doEDTA hoặc tạo thành muốiMg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao). Phảnứng PCR có thể nhân được đoạngene dài 10 Kb nhưng trong thực tếthường dùng để nhân các đoạn cókích thước ngắn hơn ( mM Taq 1U polymerase KCL 50 mM Tris HCL 10 mM (pH 8.4) tại 25oC MgCl2 2.85 mM Gelatin 100 mg/l Nonidet-40 0.05% Số chu kỳ cho phản ứng tạo sảnphẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ.Điều chú ý là các mồi cho phảnứng phải có nhiệt độ bắt cặp vớiADN đích gần nhau, có trình tựkhông bổ sung nhau để tránh bắtcặp với nhau. Trình tự đầu 3’ củacác mồi cũng phải khác với trình tựvùng trung tâm của sản phẩm đểtránh tạo thành hiện tượng kẹp tóc.Nói chung, ngày nay người ta cóthể tối ưu hoá việc chọn mồi nhờ sựtrợ giúp của các chương trình máytính. Đôi khi cũng xuất hiện hiệntượng nhân sản phẩm PCR khôngđặc hiệu, điều này thường hay xuấthiện khi dùng các cặp mồi suy biếntừ chuỗi acid amin. Tuy nhiên tronghầu hết các trường hợp này thì việcthay đổi điều kiện phản ứng có thểhạn chế được các sản phẩm khôngmong muốn. Các thành phần nhưnhiệt độ, nồng độ Mg++ và enzymcó ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu.Sự có mặt của nonidet-40 có tácdụng tăng hiệu suất của phản ứng. Việc ứng dụng kỹ thuật RFLPvới sản phẩm PCR có thể là cáchnhanh chóng để tìm sự khác biệtđối với các gene khác nhau. Vớicách này yêu cầu sản phẩm PCRphải sạch và đồng nhất. Theo cáchnày trình tự có thể được thực hiệnnhư sau: Sau khi điện di kiểm trađộ sạch của sản phẩm PCR, tiếnhành kết tủa với ethanol. Kết tủađược hoà với đệm thích hợp và sauđó được xử lý với enzym cắt hạnchế thích hợp. Kiểm tra kết quảthông thường trên gel agarose,trong một số trường hợp có thể trêngel polyacylamid để thu được độphân giải cao hơn. Chú ý rằngthông thường hoạt tính enzym giảm5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậycó thể ước lượng 50% hiệu quảkhuyếch đại mất đi trong toàn bộquá trình phản ứng. + Một số khó khăn với phảnứng PCR: PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớntrong nghiên cứu sinh học phân tửnhưng cũng nảy sinh một số vấn đềcần chú ý đặc biệt khi phát hiệnmộ ...