phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt)

Lai ADN Nguyên tắc được tiến hành như sau: ADN tổng số được tách ra và xử lý với enzym cắt hạn chế (có trường hợp không cần xử lý với enzym cắt hạn chế) sau đó điện di trên gel agarose và chuyển lên màng lai. Mẫu dò (probe) được chuẩn bị và lai với màng ADN ở trên. Kết quả phép lai cho biết sự khác biệt giữa các mẫu ADN khác nhau.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt) 2.2. Lai ADN Nguyên tắc được tiến hành nhưsau: ADN tổng số được tách ra vàxử lý với enzym cắt hạn chế (cótrường hợp không cần xử lý vớienzym cắt hạn chế) sau đó điện ditrên gel agarose và chuyển lênmàng lai. Mẫu dò (probe) đượcchuẩn bị và lai với màng ADN ởtrên. Kết quả phép lai cho biết sựkhác biệt giữa các mẫu ADN khácnhau. Phép lai được tiến hành ở đâydựa vào cấu trúc sợi đôi ADN từhai sợi đơn với các cầu liên kếthydrogene theo nguyên tắc bổsung. Bắt đầu là đứt gãy các liênkết hydrogene do hoá chất (kiềm)hay biến tính nhiệt, lúc này hai sợiđơn ADN tách nhau được gọi làtrạng thái biến tính ADN(denature). Nếu tại thời điểm nàyngười ta cho vào một ADN đánhdấu biến tính (mẫu dò) sau đó tạođiều kiện hồi biến xuất hiện(renature), lúc đó sẽ cho phép cácsợi đơn của mẫu dò bắt cặp với cácsợi đơn của mẫu ADN ban đầu(target ADN). Mức độ lai sẽ phụthuộc vào tính đặc hiệu (sự tươngđồng) giữa mẫu dò và mẫu gốccũng như điều kiện cho phép laithực hiện (nhiệt độ, nồng độ muối,pH, tỷ lện mẫu dò, kích thước mẫudò). Như vậy, việc chọn điều kiệnchính xác cho phép lai có ý nghĩarất quan trọng cho tính đặc hiệu củakết quả phép lai. Sau khi lai, bướctiếp theo là rửa bằng đệm thích hợpđể loại mẫu dò dư và cuối cùng làphép đo bức xạ đánh dấu (tuỳ theophương pháp đánh dấu phóng xạhay hoá chất phát xạ huỳnh quang)để đánh giá mức độ tương đồng củaphép lai. Nói tóm lại một số nhân tốtham gia vào kết quả của phép lailà: mẫu dò ADN, phương phápđánh dấu ADN, mẫu ADN lai vàđiều kiện tiến hành và phương phápđánh giá kết quả phép lai. + Chọn mẫu dò: Việc chọn mẫu dò có ý nghĩaquan trọng cho phép lai. Nhìnchung các nhà phân loại học vi sinhvật thường không trực tiếp thiết kếmẫu dò. Về mặt này chúng tôi đưara một số nội dung chủ yếu về tiêuchí chọn mẫu dò theo Stahl vàAmann (1991) như sau: Mẫu dò sẽlai với ADN đích (target) và khônglai với các nguồn ADN khác có mặttrong mẫu lai. Khi phân tích cácmẫu vi sinh vật với nhau thì mẫudò nên là đoạn nucleotid đặc trưngcho các mẫu phân tích để phân biệtvới các sinh vật khác. Tuy việcchọn mẫu dò cũng mang tính kinhnghiệm, mẫu dò đôi khi không cầnphải là toàn bộ gene mà chỉ là mộtđoạn gene mã hoá cho một đặc tínhđặc trưng cho đối tượng nghiên cứu(có thể là yếu tố kháng nguyên bềmặt, độc tố hay một gene chứcnăng nào đó trên plasmid). Vớicách chọn mẫu dò có kích thướcnhỏ (14-40 bp), có thuận lợi là cácmẫu dò được tổng hợp nhân tạo vàphép lai thực hiện nhanh (dưới 30phút) trong khi đó với các mẫu dòlớn thời gian kéo dài hơn (khoảng16 giờ). Hạn chế lớn nhất đối vớicác mẫu dò nhỏ là khó khăn khiđánh dấu và dẫn đến giảm tính đặchiệu của phép lai. Một cách thường được sửdụng là thiết kế các mẫu dò từ cácchuỗi ARN thông tin 16S. Cáchchọn có thể căn cứ vào đoạn ADNcó mặt trong các đại diện mức độdưới loài, trong loài hay thuộc chinghiên cứu. + Các phương pháp đánhdấu: Các kỹ thuật đánh dấu ADNđược xem là lĩnh vực phát triểnmạnh nhất trong sinh học phân tử.Nói chung kỹ thuật đánh dấu đượcchia thành kỹ thuật đánh dấu trựctiếp và gián tiếp. Trong phươngpháp trực tiếp thì phần đánh dấu đểphát hiện được gắn vào acidnucleic. Đối với phương pháp giántiếp thì có một phần chức năngđược gắn vào acid nucleic và phầnnày lại được phát hiện gián tiếp dựavào protein bám đặc hiệu được pháthiện bằng kỹ thuật miễn dịch. Sauđây là chi tiết các phương phápđánh dấu. · Đánh dấu trực tiếp: - Bảng dưới đây đưa ra các loạicơ chất dùng cho phương phápđánh dấu trực tiếp dựa vào việcnhân ADN được đánh dấu lên sẽtăng độ nhạy so với phương phápđánh dấu chỉ được thực hiện vớicác mồi đơn lẻ. Đối với các phươngpháp đánh dấu trực tiếp thì cácnhóm tạo tín hiệu được gắn trựctiếp bằng liên kết hoá trị vớinucleic của mẫu dò. - Đánh dấu trực tiếp bao gồm 2bước chính: tạo tín hiệu dựa vàoliên kết hoá trị của nhóm tín hiệuvới mẫu dò và thực hiện phép laigiữa mẫu nghiên cứu và mẫu dò.Bảng 1.4. Một số cơ chất dùng cho đánh dấu trực tiếp. Nguồn tạo tín Tài liệu hiệu 32 P Southern 35 S (1975) Alkaline Collins& phophatase Hunsaker (1985) Ethidium Renz&Kurz Fluorescein (1984) Horseradish Albarella & peroxidase ADNerson(19Microperoxidase 86)Nitrobenzofuran Amman & ctvTetramethylorhod (1988) amine Urdea ctv(1988) Heller& Shneider(1983 ) Draper (1984) Amman&ctv( 1990)Hình 1.3. Minh hoạ phương pháp đánh dấu trực tiếp (A) và gián tiếp (B) ...