Phân tích acid nucleic – Phân tích ADN nhiễm sắc thể

Phương pháp phân tích ở đây bao gồm việc tách ADN của nhiễm sắc thể và cắt bằng enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các vi sinh vật với nhau. Một chú ý khi tách ADN nhiễm sắc thể phải thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do nguyên nhân cơ học. Nói chung các mảnh cắt nên có kích thước nhỏ hơn hoặc bằng 50 kb. Việc tách các mảnh cắt đó được thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong trường xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis ).style="text-align: justify; margin-top: 6.0pt"...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân tích acid nucleic – Phân tích ADN nhiễm sắc thể Phân tích acid nucleic – Phân tích ADN nhiễm sắc thể Phương pháp phân tích ở đây bao gồm việc tách ADN của nhiễm sắc thể vàcắt bằng enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các vi sinh vật với nhau. Một chú ýkhi tách ADN nhiễm sắc thể phải thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do nguyênnhân cơ học. Nói chung các mảnh cắt nên có kích thước nhỏ hơn hoặc bằng 50 kb.Việc tách các mảnh cắt đó được thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong trườngxung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis ).style=text-align: justify; Như vậy kỹ thuật dấu vân tay không chỉ áp dụng trongmargin-top: 6.0pt>trường hợp trên tế bào mang plasmid mà kỹ thuật này còn được sử dụng với nhiễmsắc thể cho mọi trường hợp.rường hợp.ường hợp.ường hợp. Liên quan đến vấn đề này phải kể đến kỹ thuật BRENDA: phân tích kết quảxử lý enzym cắt hạn chế với vi sinh vật. Ở đây cách chọn loại enzym cắt hạn chếvô cùng quan trọng, theo cách chọn này có thể tạo ra quá nhiều mảnh cắt nênkhông thể phân biệt được các băng riêng rẽ trong khi đó đối với các trường hợpkhác lại tạo ra quá ít mảnh cắt có kích thước lớn khó tách theo các kỹ thuật điện dihiện có. Các vi sinh vật khác nhau có tỷ lệ GC khác nhau (dao động từ 25 -75%)các mảnh cắt thu được sau khi xử lý enzym cắt hạn chế rất khác nhau. Theo NeiM. và Li W. H. (1979) thì số mảnh cắt có thể thu được tính trên lý thuyết là:a = (g/2)r1 x {1-(g/2)}r2 Trong đó: g - tỷ lệ GC của ADN r1 - số cặp GC r2 - số cặp AT trong vị trí cắt của enzym giới hạn sử dụng a - số vị trí cắt khi sử dụng enzym cắt hạn chế. Mặt khác, người ta cũng căn cứ vào kết quả nghiên cứu các vị trí cắt của bộgene vi sinh vật làm cơ sở cho cách chọn enzym cắt. Thông thường cho mỗi phépphân tích người ta ghi được số các băng cắt bởi enzym và tính toán kích thước cácmảnh tạo thành làm cơ sở cho các phép phân tích về sau. Tuy nhiên, một trongnhững nguyên nhân hạn chế cho phép phân tích trên là các phương pháp táchADN thông thường đều dẫn đến thay đổi kích thước do đứt gãy ADN nhiễm sắcthể, mặt khác sự có mặt của plasmid lẫn cũng tạo ra sự khác biệt giả trong kết quảphân tích, để khắc phục nhược điểm trên người ta phải thực hiện phép phân tíchADN nhiễm sắc thể nguyên vẹn để phát hiện các nguồn ADN tạp nhiễm lẫn vàokết quả phân tích. + Kỹ thuật điện di trong trường xung điện (điện di trong trường điện thayđổi, PFGE) - Nguyên tắc: Trước tiên các mẫu đưa vào phân tích phải được xử lý trướcbằng loại enzym cắt hạn chế mà có rất ít điểm cắt. Kết quả phải tạo ra được cácmảnh có kích thước lớn (50 kb – 12 Mb), với kích thước này không thể điện ditheo phương pháp thông thường mà chỉ có thể tách ra bằng kỹ thuật PFGE (ậtPFGE (ật PFGE (uật PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis ). Kỹ thuật PFGElần đầu tiên được Schwartz va Cantor (1984) giới thiệu. Tuy nhiên sau đó đã cónhiều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, tuy có sai khác ít nhiều nhưng cơ sở lý thuyếtcủa các phương pháp này là như nhau: Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năngdi động của các mảnh ADN có kích thước lớn trong điện trường, do đó các thànhphần gel và đệm hầu như không thay đổi theo các phương pháp điện di thôngthường. Tuy nhiên theo phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sựdi động của các mảnh ADN có kích thước khác nhau trên gel agarose trong mộttrường điện không đổi. Kết quả ở đây là phân tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏqua mắt xích agarose, tạo ra sự tách biệt trong trường điện di. Trong trường hợpPFGE lực làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tụcdẫn đến các mảnh ADN có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động. Như vậykết quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau.Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm. Sự di động khác nhau củaADN chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ không phải do gel agarose nh ư ởphương pháp điện di thông thường, hình 1.2.Hình 1.2. Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thểsau khi xử lý với Sma I với 7 chủng Haemophilus ìnluenzae. Tiếp theo các mô tả của Schwartz va Cantor, Smith và Codemine (1990) đãđề cập đến sự di chuyển của các mảnh ADN khác nhau là hàm số tuyến tính vớikích thước của chúng. Trên cơ sở đó có thể điều chỉnh các xung điện và điệntrường. Tuy nhiên các nhân tố khác cũng có mối tương tác lẫn nhau và ảnh hưởngđến khả năng di động của ADN như: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose cũng nh ưnồng độ ion trong đệm. - Chuẩn bị ADN cho PFGE: Chuẩn bị ADN từ nhiễm sắc thể không giốngnhư các phương pháp chuẩn bị ADN plasmid. Một vấn đề th ường xảy ra là sự đứtgãy ngẫu nhiên ADN dẫn đến sai khác trong kết quả phân tích. Để hạn chế điềunày người ta phải thực hiện kỹ thuật tách ADN NST ...