Phân tích trình tự nucleotit gen hormon sinh trưởng

Số lượng hormone sinh trưởng ở lợn có liên quan đến khả năng vỗ béo, thành phần thân thịt, chất lượng thịt và khả năng chống lại các stress (Geldmann và cộng sự, 1997). Sự đa hình gen hormone sinh trưởng còn ảnh hưởng đến khả năng tăng trọng ngày, tỷ lệ nạc, mỡ và nồng độ hormone sinh trưởng trong huyết thanh (Nielsen và cs, 1995). Sự khác biệt về số lượng hormone sinh trưởng là do sự sai khác di truyền ở gen hormone sinh ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân tích trình tự nucleotit gen hormon sinh trưởng Phân tích trình tự nucleotit gen hormon sinh trưởngcủa một số giống lợn Việt nam1.Giới thiệuSố lượng hormone sinh trưởng ở lợn có liên quan đếnkhả năng vỗ béo, thành phần thân thịt, chất lượng thịtvà khả năng chống lại các stress (Geldmann và cộngsự, 1997). Sự đa hình gen hormone sinh trưởng cònảnh hưởng đến khả năng tăng trọng ngày, tỷ lệ nạc,mỡ và nồng độ hormone sinh trưởng trong huyếtthanh (Nielsen và cs, 1995). Sự khác biệt về số lượnghormone sinh trưởng là do sự sai khác di truyền ởgen hormone sinh trưởng và các gen điều hoà kháccủa trục hormone.Gen hormone sinh trưởng của lợn nằm trên cánh tayp của nhiễm sắc thể số 12 (Yerle và cs, 1993;Chowdhary và cs, 1994) vùng mã hoá gồm 5 exon cóchiều dài khoảng 1,7 kb (Vize và Wells, 1997).Mục đích của chúng tôi là tiến hành giải trình tự đoạngen từ nucleotit 380 đến nuleotit 802 của một sốgiống lợn nội nhằm phát hiện ra sự thay đổi của mộtsố nuleotit trong exon II của gen hormone sinhtrưởng.2. Đối tượng và phương pháp2.1. Đối tượng: ADN được tách từ mẫu máu của các giống lợn nội (Móng Cái, ỉvà H?mông).2.2. Phương pháp lấy mẫu và tách ADN: Mỗi mẫu lấy 0,5 ml máu (chống đôngbằng EDTA) và sử dụng 100 m l máu để tách ADN theo phương pháp kít củahãng Sepagene (Nhật bản). Phương pháp nhân gen (PCR): Chúng tôi sử dụng primer được thiết kế2.3bởi Eiji Kobayashi và cs (1999), có trình tự như sau: 5?-GAGGCCAAGTTTTAAATGTCCCTG-3?Mồi xuôi:Mồi ngược: 5?-GTGTAAACTGAAGGGGATTCCCAA-3?Thành phần và điều kiện phản ứng PCR theo p hương pháp Eiji Kobayashi và cs(1999). Phương pháp giải trình tự gen: Giải trình tự nucleotit được thực hiện theo2.4các bước sau: Sản phẩm sau PCR được làm sạch bằng Pre-sequence kít: gồm 5 ml ADN-PCR cần xác định trình tự, 0,5 m l exonuclease III (10 UI trong 20 mMTris-HCl pH7,5; 5 mM 2 mercaptoethanol; 50% Glycerol); 0,5 m l shrimpalkaline phosphatase (2 UI/ m l trong 25 mM Tris-HCl pH7,6; 1 mM MgCl2;0,1mM ZnCl2; 50% Glycerol). ủ phản ứng ở 370C trong 15 phút, sau đó ủ ở800C. Thêm vào phản ứng 2 m l Big dye terminator, 3 m l 5x Buffer, 9 m l nướccất và 5 pmol ADN mồi (xuôi hoặc ngược). Thực hiện phản ứng nhân gen gồm 25chu kỳ với chu kỳ nhiệt như sau: 940C/30 giây, 500C/10 giây, 600C/ 4 phút. K ếtthúc phản ứng nhân gen mẫu được lọc qua cột G-50 Superfine và giải trình tự trêncả hai sợi ADN của gen hormone sinh trưởng.3. Kết quả và thảo luận:3.1. Kết quả nhân gen (PCR):Chúng tôi sử dụng phương pháp PCR nhân đoạn gen dài 422 bp từ 3 giống lợn nộikhác nhau, kết quả được thể hiện qua ảnh 1.M: marker số 10 (pBR322/MspI); Hàng 2-7: Đoạn gen nhân sau PCR.3.2. Kết quả giải trình tự:Giải trình tự trực tiếp sản phẩm sau PCR cho thấy ở vị trí nucleotit 507 thì G/Cđược thay bằng C/T (ảnh 2), G/C ở vị trí nucleotit 555 được thay bằng G/A và ở vịtrí nucleotit 556 thì C/G được thay bằng C/A. Do C/T thay cho G/C ở vị trínucleotit 507 tạo nên 2 bộ ba mã hoá GTG thay cho GCG. ở hai vị trí nucleotit555 (G/A) và 556 (C/A) tạo ra 4 bộ ba mã hoá là GGC, GGA, GAC và GAA (ảnh3) từ đó tạo nên những axit amin mới.3.3. Thảo luận:Kết quả giải trình tự gen hormone sinh trưởng từ 3giống lợn nội cho thấy ở vị trí 506-509 nếu có sự thaythế C/T ở vị trí 507 sẽ tạo ra hai bộ ba mã hoá (GCGvà GTG) do đó tạo ra axit amin mới là Alanine(GTG) thay cho valine (GCG) trong trình tự axítamin (Pirchner và cs, 1996). Ngoài ra còn có 2 axitamin khác được tạo ra bởi sự thay thế G/A ở vị trínucleotit 555 và C/A ở vị trí nucleotit 556 cũng dẫnđến sự thay thế các axit amin mới trong trình tự axitamin (Kirkpatrick và cs, 1993) đó là từ Glycine(GGC hoặc GGA) thành Glutamic (GAA) hoặc từAspartic (GAC) thành Glutamic (GAA). Chính sựthay đổi các nucleotit trong vùng exon II đã tạo nênsự đa hình của gen hormone sinh trưởng ở lợn. Từ đóảnh hưởng trực tiếp tới hàm lượng hormone sinhtrưởng có trong huyết thanh của lợn.4. Kết luận:Đoạn gen hormone sinh trưởng của 3 giống lợn:Móng Cái, ỉ, H?mông, được nhân lên từ nucleotit 380đến nucleotit 802 có độ lớn 422 bp nằm trong vùngintron I, exon II và intron II của gen hormone sinhtrưởng.Trong vùng exon II, trình tự của các nucleotit có sựđột biến tại các điểm nucleotit vị trí 507, 555 và 556đã tạo nên sự thay đổi trình tự axit amin trong phântử Protein mà gen mã hoá từ đó tạo nên sự đa hìnhcủa gen hormone sinh trưởng của lợn.5. Tài liệu tham khảo1. C. Knorr; G.Moser; E.Muler and Geldmann :Association of GH gene veriantswith performce traits in F2 generation of European wild boar,Pietrain and Meishanpigs. Anim.Genet,1997, 28:124-128.2. Chowdhary,B.P; Thomsen,P.D; Harrbitz,L; Landset,M; Gustarsson,I; 1994:Precise localization of the genes for Glucose Phosphate Isomerase(GPI), calciumrelease chanel (CRC), hormone sensitive lipase(LIPE), and growth hormone(GH)in pigs using nonradioactive in situ hybridization. Cytogenet.cell genet. 67, 211-214.3. Eiji Kobayashi, Shin-ich Shimanuki, Toshimi Matsumoto, Santoshi Yanai,Tomiji Akita and Mitsuzu Minezawa: Genetic variations of the porcine growthhormone gene. The Journal of Animal Genetics Vol.27, N0 March 1999.4. Kirkpatrick,B.W,1992: Hae III and MspI polymorphisms are detected in thesecond exon of the porcine growth hormone gene. Anim.Genet 23:180 -181.5. Kirkpatrick,B.W; Casa.S and Carillo,E.1993: Double -strand DNA cofirmationpolymorphisms as a source of highly polymorphic genetic markers. Anim.Genet24:155-161.6. Nielsen,V.H; Larsen,N.J; Agergaard,N.1995 : Association of DNApolymorphism in the growth hormone gene with basal plasma growth hormoneconcentraction and production traits in pigs. J.Anim. Breed genet.112:205-212.7. Vize,P.D, Wells J.R.E 1987: Isolation and charactorization of the porcinegrowth hormone gene. Gene 55: 339-344.8. Yerle,M; Lahbib-Mansais,Y; Thomsen,P.D; Gellin,J,1993: Localization of theporine growth hormone gene to chromosome 1 ...