PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP VỚI VENT ADN POLYMERASE

Bệnh Hemophilia A liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIII. VentADN polymerase có khả năng xúc tác tổng hợp ADN mới chính xác hơn so với Taq ADN polymerase. Mụctiêu: Xác định qui trình phát hiện đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIIIsử dụng Vent ADN polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP. Phương pháp: Phản ứng chuỗi PCR và cắtenzyme giới hạn RFLP. Kết quả: Phát hiện được 16 trên 29 mẫu bệnh nhân Hemophilia A có đột...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP VỚI VENT ADN POLYMERASE TCNCYH 38 (5) - 2005 PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP VỚI VENT ADN POLYMERASE Nguyễn Hoài Giang 1, Nguyễn Hạnh Phúc 1 Phạm Quang Vinh 2 1 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 2 Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương Bệnh Hemophilia A liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIII. VentADN polymerase có khả năng xúc tác tổng hợp ADN mới chính xác hơn so với Taq ADN polymerase. Mụctiêu: Xác định qui trình phát hiện đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIIIsử dụng Vent ADN polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP. Phương pháp: Phản ứng chuỗi PCR và cắtenzyme giới hạn RFLP. Kết quả: Phát hiện được 16 trên 29 mẫu bệnh nhân Hemophilia A có đột biến ởintron 18. Cũng trong số bệnh nhân này, chúng tôi chưa phát hiện được trường hợp nào mang đột biến ởintron 19. Kết luận: Hình thành được qui trình phát hiện đột biến Hemophilia A bằng PCR - RFLP. Quitrình có thể ứng dụng để phát hiện các phụ nữ mang gen bệnh và chẩn đoán sớm trước sinh bệnhHemophilia A. Từ khóa: Hemophilia A, PCR, RFLP, Vent ADN polymeraseI. ĐẶT VẤN ĐỀ (1/290 đến 1/2.400) [3, 5]. Những đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII là Hemophilia (bệnh ưa chảy máu) bao gồm các đột biến mất vị trí nhận biết của enzyme giới hạnđột biến ở gen mã hoá cho yếu tố đông máu số Bcl I và Hind III [2, 4]. Do vậy, độ chính xác củaVIII (Hemophilia A) và ở gen của yếu tố IX các sản phẩm PCR so với khuôn mẫu ADN ban đầu(Hemophilia B). Hemophilia A là bệnh di truyền liên rất quan trọng, nó đảm bảo kết quả chẩn đoánquan đến nhiễm sắc thể X. Ước tính có khoảng từ phát hiện đột biến ở bệnh nhân Hemophilia A.1/5000 đến 1/10.000 các bé trai sinh ra mắc bệnh Mục tiêu: Xác định qui trình phát hiện độtnày. Gen mã hoá cho yếu tố đông máu số VIII biến ở intron 18 và 19 của gen mã hóa chonằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể tại vị trí yếu tố đông máu số VIII sử dụng Vent ADNXq28. Gen này rất lớn (khoảng 180 kb) bao gồm polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP26 exon [2]. Các đột biến của gen mã hoá cho yếutố VIII được phát hiện một cách nhanh chóng và II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁPchính xác bằng kỹ thuật PCR kết hợp với phân tích NGHIÊN CỨURFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 1. Đối tượng[2, 4]. Các mẫu máu của bệnh nhân Hemophilia A (29 Cũng giống như Taq ADN polymerase, một mẫu) được cung cấp bởi Viện Huyết học và Truyềnenzyme polymerase được dùng phổ biến trong kỹ máu Trung ương. Các mẫu máu của người bìnhthuật PCR, Vent ADN polymerase cũng có khả thường khoẻ mạnh (25 mẫu) được cung cấp bởinăng xúc tác tổng hợp các sợi ADN mới. Các Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Các enzyme Taqnghiên cứu cho thấy Vent ADN polymerase có ADN polymerase, Vent ADN polymerase, cácnhiều ưu điểm vượt trội so với Taq ADN enzyme giới hạn Bcl I và Hind III và thang ADNpolymerase [5]. Vent ADN polymerase bị mất 50% chuẩn 100bp sử dụng cho nghiên cứu này là củahoạt tính xúc tác sau 130 phút ở 97,5oC, so với 10 hãng New England Biolabs (Mỹ).phút của Taq ADN polymerase. Tốc độ tổng hợpsợi ADN mới của Vent ADN polymerase (trên 80 2. Phương pháp nghiên cứunucleotide/giây) cũng nhanh hơn so với Taq ADN - Tách chiết ADN từ các mẫu máu của bệnhpolymerase (75 nucleotide/giây). Vent ADN nhân Hemophilia A và người bình thường khoẻpolymerase lại ít gây lỗi khi xúc tác tổng hợp sợi mạnh được cải tiến theo phương pháp củaADN mới (1/31.000) so với Taq ADN polymerase Sambrook và cộng sự [6]. 1TCNCYH 38 (5) - 2005 - Cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 (18F và 18R) pháp đã cải tiến của Sambrook và cộng sự [6]. Kếtvà intron 19 (19F và 19R) của gen mã hoá yếu tố quả đo OD ở bước sóng 260nm cho thấy tất cả cácVIII được tiến hành phản ứng PCR với Taq ADN mẫu ADN tách chiết được đều đủ điều kiện để tiếnpolymerase theo nghiên cứu của Kogan và cộng sự hành phản ứng PCR. Đầu tiên, chúng tôi tiến hành[4]. phản ứng PCR với Taq ADN polymerase và cặp mồi Trình tự của các cặp mồi là 18F và 18R theo các thông số đã được tối ưu bởi Kogan và cộng sự. Tiếp theo để sử dụng Vent ADN18F: 5’-TAA AAG CTT TAA ATG GTC TAG GC-3’ polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP phát hiện18R: 5’-TTC GAA TTC TGA AAT TAT CTT GTT C-3’ các đột biến của bệnh Hemophilia A, chúng tôi tiến19F: 5’-AAG GTC CTC GAG GGC GAG CAT-3’ hành tối ưu hoá điều kiện cho PCR với e ...