Phát hiện hai nhóm Escherichia Coli Epec và Eiec gây tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật PCR

Dựa trên sự khác biệt trong cấu trúc genome của từng nhóm, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã ứng dụng thành công kĩ thuật PCR với hai cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 2 trong số 5 nhóm khác nhau của E.coli gây tiêu chảy từ các chủng chuẩn EPEC và EIEC.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện hai nhóm Escherichia Coli Epec và Eiec gây tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật PCRNguyễn Phú Hùng và csTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ65(03): 155 - 158PHÁT HIỆN HAI NHÓM ESCHERICHIA COLI EPEC VÀ EIECGÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCRNguyễn Phú Hùng1*, Phạm Thị Nhàn1Lê Thị Thu Hà1, Lê Thành Công1Phùng Đắc Cam21Trường Đại học Khoa Học – ĐH Thái Nguyên2Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương)TÓM TẮTEscherichia coli là tác nhân gây bệnh tiêu chảy ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Đây là đốitượng gây viêm ruột theo nhiều cơ chế khác nhau. Dựa trên cơ sở này, E.coli gây tiêu chảy đượcphân thành các nhóm khác nhau là ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC, mỗi nhóm có một cơ chếsinh bệnh đặc trưng. Dựa trên sự khác biệt trong cấu trúc genome của từng nhóm, trong nghiêncứu này, chúng tôi đã ứng dụng thành công kĩ thuật PCR với hai cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 2trong số 5 nhóm khác nhau của E.coli gây tiêu chảy từ các chủng chuẩn EPEC và EIEC. Đây làtiền đề quan trọng để chúng tôi tiến hành tối ưu hoá và phát triển thành bộ sinh phẩm phát hiệnnhanh tác nhân gây tiêu chảy là E.coli ở người. Ƣu điểm của kỹ thuật là này cho phép phát hiệntác nhân gây bệnh với độ đặc hiệu gần như 100%.Từ khóa: Tương đồng di truyền, tiêu chảy, PCR, nhiễm trùng bệnh viện, Ecoli.ĐẶT VẤN ĐỀTiêu chảy là một bệnh phổ biến trên toàn cầu,đặc biệt là ở các đang phát triển. Việt Nam lànước nằm trong vùng nhiệt đới, điều kiện vệsinh kém, vì vậy bệnh tiêu chảy khá phổ biến.Theo các nghiên cứu mới đây, bệnh tiêu chảyở nước ta đứng thứ nhất trong 10 bệnh phổbiến nhất và đứng hang thứ tư trong 10 bệnhcó tỉ lệ tử vong cao nhất. Trẻ em là đối tượngdễ mắc tiêu chảy nhất, trung bình trẻ dưới 5tuổi mỗi năm mắc tiêu chảy 2 – 2,2 lần [2],[3]. Có nhiều tác nhân sinh học khác nhau dẫntới tiêu chảy ở người như: tác nhân là virus(ví dụ: virus rota, virus adeno, virusNorwalk…), kí sinh trùng (ví dụ: giun tròn,sán dây, sán lá, các loại đơn bào (protozoa) vàvi khuẩn (Escherichia coli, Shigella, Vibriocholera…). Để kiểm soát dịch tiêu chảy, côngtác chẩn đoán, xác định tác nhân gây bệnh giữmột vai trò đặc biệt quan trọng. Trong số cáctác nhân kể trên, E.coli là đối tượng đượcquan tâm và nghiên cứu nhiều. Các E.coligây tiêu chảy được chia làm 5 nhóm là: E.coligây bệnh đường ruột(Enteropathology E.coli**– EPEC); E.colisinh độc tố ruột(Enterotoxigenic E.coli – ETEC); E.coli xâmnhập ruột (Enteroinvasive E.coli – EIEC),E.coligâyxuấthuyếtruột(Enterohaemorrhagic E.coli – EHEC) vàE.colibámdínhđườngruột(Enteroaggregative E.coli – EAEC). Hiện đãcó nhiều công trình nghiên cứu về chẩn đoánphân biệt các nhóm E.coli gây bệnh khácnhau đã được thực hiện[1], [4],[5], [10]. Trongbáo này, chúng tôi đã tiến hành áp dụng kĩthuật PCR đặc hiệu để xác định chính xác hainhóm E.coli là EPEC và EIEC trong 5 nhómnêu trên. Đây là một phần trong nghiên cứucủa chúng tôi về ứng dụng kỹ thuật PCR đểxác định 5 nhóm E.coli gây tiêu chảy ở người.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨUNguyên liệu nghiên cứu là các chủng E.colichuẩn quốc tế do Giáo sư Phùng Đắc Cam,Phòng Vi khuẩn đường ruột - Viện vệ sinhdịch tễ Trung ương cung cấp.Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số vàcác loại hóa chất chuyên dụng dùng cho cáckỹ thuật sinh học phân tử có chất lượng tốt,do các hãng có uy tín cung cấp.Tel 0914791904, Email: hungnguyenphu@gmail.com155Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyênhttp://www.Lrc-tnu.edu.vnNguyễn Phú Hùng và csTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆPhương pháp nghiên cứu bao gồm phươngpháp tách chiết DNA tổng số từ các chủng vikhuẩn làm nguyên liệu cung cấp cho các phảnứng PCR. Phương pháp khuếch đại gen đíchbằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNKết quả tách DNA tổng của vi khuẩn E.coliTừ các chủng E.coli chuẩn quốc tế: EPEC,EIEC và chủng đối chứng EC được giữ trongống thạch nghiêng, chúng tôi lấy một vàikhuẩn lạc đem nuôi cấy trong môi trường LBlỏng ở nhiệt độ 370C qua đêm. Dịch nuôi cấyđược li tâm, thu sinh khối để tiến hành táchchiết và tinh sạch DNA tổng số. E.coli là vikhuẩn gram âm, do đó trong nghiên cứu nàychúng tôi đã tiến hành tách chiết theo phươngpháp của Sambrock và cộng sự. DNA thuđược trong quá trình tách chiết được kiểm trabằng phương pháp điện di và phương pháp đomật độ quang bằng máy quang phổ. Kết quảđiện di DNA tổng số được trình bày tronghình 2.1. Từ kết quả điện di cho thấy, cácphân tử DNA thu được ít bị đứt gãy, có mộtbăng gọn duy nhất. Các băng xuất hiện với độđậm khi nhuộm bằng ethidium bromide đãchứng tỏ phương pháp tách chiết cho phép thuđược một lượng DNA lớn. Tiếp theo chúngtôi tiến hành xác định nồng độ DNA bằngphương pháp quang phổ làm cơ sở để phaloãng DNA đến nồng độ cuối cùng cho phảnứng PCR đặc hiệu. Kết quả điện di DNA tổngsố được trình bày trong hình 1.Hìnhquả1. DNAtổng sốcủagenđối tượngnghiênnhómcứu:Kếtkhuếchđạiđặc hiệuEPEC1. Chủng EPEC; 2 Chủng EIECCơ chế ...