Phát hiện virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) trên ong mật ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam

Ðể định hướng cho việc nghiên cứu chế tạo bộ kit chẩn đoán virus BQCV ở ong mật, chúng tôi bước đầu thực hiện nghiên cứu phát hiện virus BQCV bằng RT-PCR. Trên các mẫu ong mật ở Việt Nam. Mời các bạn tham khảo!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) trên ong mật ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6 NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH THỐI ĐEN MŨ CHÖA (BLACK QUEEN CELL VIRUS) TRÊN ONG MẬT Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM HÀ THỊ QUYẾN, T g i học Công nghệ, i học Quốc gia Hà Nội HÀ THỊ THU, BÙI THỊ THÙY DƢƠNG, ĐỒNG VĂN QUYỀN Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Vệ N ố ,Vệ N Á ỉ T ậ ệ ườ T ở ệ Q ố , ờ ế ậ ứ ứ ẩ D liệu xu t khẩu ă ệ ậ ệ US ậ ế ,Vệ N ư M c dù vậy, nh ng ă ầ , ố ổ ì ì ệ ồ ư ứ ệ ậ ờ ầ , ởVệ N ong b mắc bệnh, chủ yếu do virus. Vì ậ , ườ kháng sinh ệ do virus, vi khuẩn. ứ ứ ẩ ă ệ ệ ẩ ậ ế ố trên ong mật do virus black queen cell (BQCV) ệnh ổ ế ổ ườ ởVệ N K thành tế bào ủ xu t hiện các m , ườ ố (Bailey & Wood, 1977). ế ệ N ổ ứ ệ ệ ễ Q V, ọ virus này (a) (b) Hình 1: (a) Ấu trùng chúa của ong mật bị nhiễm BQCV; (b) Nhộng bị nhiễm BQCV Q V ườ A) G k Đ ẩ ệ ệ , ươ (không ẩ ư ệ ứ ệ ọ , ế ọ và ọ Đ ứ ứ ươ ệ ệ ở ậ ư ươ ễ (ELISA, W , ) RT-PCR, multiplex RT-PCR, RFLP, (Grabensteiner et al., 2007; Mongi et al., 2001). ủ ệ ứ RNA ơ ồ ứ ọ ở ORF ORF (Kondreddy et al., 2013; Leat et al., 2000). ươ ư é 1621 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6 ươ C ế ườ ế ố ố ư ư T Hơ ư ố ư , ỹ ệ , ệ ủ ẩ ậ ẩ ậ virus ừ Đ ệ ệ RT-P R ì ơ ỉ ệ ế ì ừ ẩ ố ì ệ , ở ì ầ ế ệ ồ ệ ệ é , ừ kit mua ủ ờ ư Đ ư ng cho việc nghiên cứu chế t o b kit chẩ Q V ở ong mật, chúng ư ầu th c hiện nghiên cứu phát hiện virus BQCV b ng RT-PCR. Trên các mẫu ong mật ở Việt Nam. I. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu Mẫ RNA ươ ẩn (tách từ ong nhiễm BQCV) và mẫu RNA âm tính chuẩn (tách từ ưởng thành kh e m ) T ậ, ậ ủ H Q ố (QIA) , ệu là BQCV(+) và BQCV(-). T ă , mẫu ưởng thành ư c thu thập t i 9 ở5 tỉnh mi n Bắc Việt Nam, ồ Đ ện Biên, Hòa Bình, Bắ G , Hư Y và Nghệ An. Mỗ ồm c mẫu ưởng thành. Mẫ ư c ký hiệu b ng các ch ư ưởng thành ký hiệu là T và u trùng ký hiệu là A. Mỗi tỉnh thu 18 mẫ ưởng thành và 18 mẫu u trùng. Mẫ ư c b o qu n trong ethanol 100% và gi ở -20o ến khi s d ng. 2. Hóa chất, sinh phẩm Bao gồm các b kit: B kit RNeasy Mini Kit 250 củ QIA tách RNA tổng số; b kit SuperSciptTMFirst-S NA S S (I ) t o cDNA; TA cloning Kit (I ) tách dòng gen; GenJETTMP R P f K (F ) tinh s ch vector tái tổ h p và s n phẩm PCR; BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) ọc trình t gen. 3. Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết RNA t ng số Các mẫ ư ẫ Khuế h ưởng thành và ư ơ S , d ng b RNeasy Mini Kit 250 củ QIA ủ ố RNA ư c hòa l i trong 30 µ ư c kh ủ RNA ư ổ Nanodrop. i ẫ RNA EP Nồ DNA ặc hiệu c a BQCV (RT-PCR) a. Tổng h p cDNA từ RNA tổng số Quy trình và thành phần ph n ứ ư : Hỗn h p 1 gồm: RNA tổng số tách từ mẫu ưởng thành (30 ng–50 ng): 7 µl; Mồi ngẫu nhiên (50 ng/µl): 3 µl; Ủ hỗn h p 1 b ng máy PCR ở 650 S trên Hỗn h p 2 gồm: 5X RT Buffer(0,5M Tris-HCl pH-8,3; 0,75M KCl; 0,03M MgCl2): 4µl; dNTP mix (10 mM): 2 µl; DTT (0,1 mM): 2 µl; Inibitor Rnase (20 u/µl):1 µl; Reverse trancriptase (20 u/µl): 1µl. 1622 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6 Bổ sung 10 µl hỗn h p 2 vào hỗn h th c hiện ph n ứng RT-PCR ì ệ n ứng tổng h p cDNA từ RNA ổ ố P R o o trong 5 phút; 42 C trong 60 phút và 70 C trong 5 phút. b. Khuế ư : o C i gen từ cDNA b ng PCR C p mồi thiết kế cho việc khuế im c hiệu của virus BQCV có trình t ư sau: BQCV-F: ‟- TGGTCAGCTCCCACTACCTTAAAC - ‟ BQCV-R: ‟- GCAACAAGAAGAAACGTAAACCAC- ‟ S n phẩm sau khi khuế i sẽ có chi u dài kho ng 701bp Chu kỳ nhiệt ph n ứng khuế i: 94oC trong 3 phút; 35 chu kỳ (gồm 94oC trong 40 giây; o o 56 C trong 40 giây; 72 C trong 1 phút); 72oC trong 8 phút; gi mẫu ở 4oC. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Kiể ính đặc hiệ củ cặp ẫ RNA ươ NA Q V Kế ệ ồi đ Từ 1. 2. 3. 4. 5. hiế kế ẩ , ẩ ế ứ P R ế P R ư ệ ở ì NA NA ồ ệ ẫ ủ Hình 2: Điện di sản phẩm RT-PCR đ ạn DNA đặc hiệu của BQCV ~701bp Kênh 1: Chỉ th DNA chuẩn Kênh 2: Mẫu BQCV(-) Kênh 3: Mẫu BQCV(+) Theo kết qu thiết kế mồi, s n phẩ P R n DNA của BQCV sẽ có ư c kho ng 701bp. Hình ện di cho th , ện di s n phẩm RT-PCR, mẫu BQCV(+) xu t hiện m t ă ư ư c củ NA c hiệu của BQCV (kho ng 701bp), còn mẫu BQCV(-) không th y xu t hiện s n phẩm. Tuy nh , chắc chắn s n phẩm P R ư c là củ Q V, ọc trình t nucleotide và so sánh v i m t số trình t ươ ồng trên GeneBank có số ă KP119603.1, KM255694.1, JX149531.1, AF ,N _ Kế ( ì ở ) ươ ồ > 96%. N ư ậy, c p mồi mà chúng tôi thiết kế r c hiệu cho BQCV và có th s d ng c p mồ ư ì RT-P R u tra phát hiện các mẫu ong nhiễm BQCV trên th a. S n phẩ P R n DNA của BQCV nói trên ư c tách dòng trong vector tách dòng R ư cs d ối chứ ươ ứu tiếp theo. 2. Phát hiện sự có mặt của BQCV trên các mẫu ong Áp d ng quy trình RT-PCR có s d ng c p mồ ết kế ở trên, chúng tôi tiến hành phát hiện s có m t của BQCV trên các mẫu ong ở 5 tỉnh: 180 mẫu RNA tổ ...